周桃莉,付雍,王艷艷,丁艷,譚章平,徐文岳

(第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病原生物學(xué)教研室,重慶 400038)

瘧疾是一種嚴(yán)重危害人類健康的熱帶傳染病。構(gòu)建的約氏瘧原蟲/斯氏按蚊實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒坏珵樘接懐懺x與蚊相互關(guān)系,而且也為研究紅外期瘧原蟲發(fā)育機(jī)制,最終預(yù)防和阻斷瘧疾的傳播提供了重要的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。付雍等[1]構(gòu)建的表達(dá)綠色熒光蛋白的重組約氏瘧原蟲BY265-GFP為瘧疾防治機(jī)制研究提供了一種更加直觀的模型,然而與野生株約氏瘧原蟲相比,重組約氏瘧原蟲BY265-GFP感染斯氏按蚊的能力明顯下降,一定程度上限制了這一模型的應(yīng)用。鑒于按蚊腸道細(xì)菌能活化按蚊天然免疫抑制瘧原蟲發(fā)育,因此,本研究觀察抗生素的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)斯氏按蚊感染重組約氏瘧原蟲BY265-GFP株的影響。

1 材料與方法

1.1 供試瘧原蟲、蚊媒和動(dòng)物

約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii)BY265-GFP株為本室構(gòu)建的基因重組瘧原蟲[1],每周用昆明株小鼠血傳1次,每5 w蚊傳1次;斯氏按蚊(Anopheles stephensi):Hor株,為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期飼養(yǎng)繁殖的穩(wěn)定蚊種。成蚊在24～26℃、相對(duì)濕度為70%～80%的養(yǎng)蚊室中飼養(yǎng);雌性昆明株小鼠,清潔級(jí),重約20 g,由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑

慶大霉素、青霉素、鏈霉素、新霉素、泛影葡胺(上海海普藥業(yè))、新生牛血清和 RPMI1640培養(yǎng)基。

1.3 抗生素糖水的配制

首先將10%的糖水高壓滅菌,按下列配方加入抗生素:每毫升糖水含慶大霉素15 μ g 、青霉素 10 U 、鏈霉素 10 μ g 、新霉素 20 μ g 。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

將3～4日齡斯氏按蚊隨機(jī)分成4籠,每籠約300只雌性按蚊,設(shè)實(shí)驗(yàn)1組(感染前后1 d都飼糖水組),實(shí)驗(yàn)2組(感染前1 d飼糖水組),實(shí)驗(yàn)3組(感染后1 d飼糖水組)和對(duì)照組(飼普通糖水組)。

1.5 重組約氏瘧原蟲感染小鼠動(dòng)物模型的建立

將液氮保存的紅內(nèi)期重組約氏瘧原蟲感染1只昆明株小鼠,當(dāng)原蟲血癥達(dá)10%以上時(shí),摘除眼球取血并離心去除血清,用PBS將沉淀紅細(xì)胞稀釋,注射12只昆明株小鼠,每只小鼠注射200 μ l紅細(xì)胞稀釋液。3 d后查原蟲血癥,當(dāng)感染小鼠內(nèi)的重組約氏瘧原蟲BY265-GFP株的配子體約為1%時(shí),供上述4組斯氏按蚊叮咬吸血,每籠隨機(jī)抽取3只小鼠供血。

1.6 斯氏按蚊卵囊的觀察和唾液腺子孢子的分離計(jì)數(shù)

卵囊的觀察:于感染后7 d用乙醚輕度麻醉蚊子,在解剖鏡下解剖蚊胃后放于顯微鏡下觀察。唾液腺子孢子的分離計(jì)數(shù)[2]:收集吸食約氏瘧原蟲感染小鼠血后16 d的斯氏按蚊(雌蚊)約300只,用乙醚輕度麻醉蚊子。去除蚊的頭腹部,將蚊的胸部組織收集于研缽中,加入少量RPMI1640培養(yǎng)基,研磨3 min,將研磨所得的勻漿液與30 ml的 RPMI1640培養(yǎng)基混合,移入50 ml離心管內(nèi),4℃,300 g離心5 min。將上清液(含子孢子)移至另一50 ml離心管內(nèi),4℃,16 000 g離心10 min。棄去上清液,加入RPMI1640培養(yǎng)基2 ml重懸子孢子沉淀。用60%泛影葡胺、新生牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基配制密度梯度離心液,取子孢子重懸液1 ml加入密度梯度離心液上面,水平離心,4℃,16 000 g離心10 min。用1 ml注射器從雙層梯離心液界面吸取富含子孢子層,加入RPMI1640培養(yǎng)基30 ml,4℃,16 000 g離心10 min。棄去上清液,用RPMI1640培養(yǎng)基1 ml重懸子孢子沉淀,在改良血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 抗生素對(duì)斯氏按蚊卵囊感染率的影響

吸血感染后7 d解剖斯氏按蚊中腸,對(duì)照組共解剖86只,卵囊陽性的 45只,感染率為 52.3%(有卵囊蚊數(shù)/檢查蚊數(shù)),實(shí)驗(yàn)1組解剖90只,卵囊陽性的89只,感染率為98.9%,實(shí)驗(yàn)2組解剖90只,卵囊陽性的88只,感染率為97.8%,實(shí)驗(yàn)3組解剖90只,卵囊陽性的48只,感染率為53.3%。以上結(jié)果說明在感染前加飼抗生素對(duì)斯氏按蚊感染瘧原蟲的卵囊發(fā)育有明顯促進(jìn)作用,大大提高了按蚊的感染率,而在感染后加飼抗生素是沒有作用的。

圖1 感染前后加飼抗生素組蚊胃卵囊 圖2 對(duì)照組蚊胃卵囊Fig.1 oocyst of the antibiotic-treated group Fig.2 oocyst of the control group

2.2 抗生素對(duì)斯氏按蚊唾液腺子孢子數(shù)量的影響

在吸血感染后16 d,采用密度梯度離心法分離唾液腺子孢子,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)各組收集100只感染蚊,分離后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)(結(jié)果見表2),對(duì)照組為5.4×105,實(shí)驗(yàn)1、2組均明顯高于對(duì)照組的子孢子數(shù),而實(shí)驗(yàn)3組與對(duì)照組差別不大,說明在感染前加飼抗生素可明顯提高唾液腺子孢子的數(shù)量,而在感染后加飼抗生素對(duì)唾液腺子孢子的數(shù)量沒有影響。

表1 抗生素對(duì)斯氏按蚊中腸感染率的影響Tab.1 Effect of antibiotic on infection rate of oocyst in Anopheles stephensi

表2 抗生素對(duì)唾液腺子孢子數(shù)量的影響Tab.2 Effect of antibiotic on sporozoite quantity in Anopheles stephensi

3 討論

瘧原蟲發(fā)育及其致病機(jī)理的研究是制定有效瘧疾防治手段的前提。由于受研究模型的限制,相對(duì)于紅內(nèi)期瘧原蟲而言,紅外期和蚊期瘧原蟲的研究相對(duì)滯緩。瘧原蟲感染按蚊模型不但有助于我們研究瘧原蟲在按蚊體內(nèi)的發(fā)育機(jī)制,而且可為紅外期瘧原蟲的研究提供重要的子孢子來源。另外,由于瘧原蟲在按蚊體內(nèi)進(jìn)行有性生殖,因此瘧原蟲感染按蚊模型還可為瘧原蟲之間的雜交以及瘧原蟲致死遺傳分析提供重要的平臺(tái)。

斯氏按蚊是瘧疾重要的傳播媒介,約氏瘧原蟲/斯氏按蚊是目前公認(rèn)的重要模型。溫度是瘧原蟲在蚊體內(nèi)發(fā)育中的關(guān)鍵性因素[3],楊松、張健等[4-7]證實(shí)斯氏按蚊絲氨酸蛋白酶基因、前酚氧化酶及酚氧化酶、T EP1基因與約氏瘧原蟲卵囊黑化有關(guān),可影響按蚊體內(nèi)卵囊的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn),雌蚊中腸是瘧原蟲在蚊體內(nèi)發(fā)育的重要場(chǎng)所,當(dāng)中腸的環(huán)境改變時(shí),對(duì)瘧原蟲的發(fā)育會(huì)產(chǎn)生影響[8-10]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),按蚊的中腸通常含有多種細(xì)菌,而細(xì)菌的存在可能通過活化按蚊的天然免疫反應(yīng),抑制瘧原蟲在蚊體內(nèi)的發(fā)育。約氏瘧原蟲BY265/斯氏按蚊是本室的常用模型,斯氏按蚊的瘧原蟲感染率和感染度通常很高。重組約氏瘧原蟲BY265-GFP株是我室構(gòu)建的能在瘧原蟲整個(gè)生活史持續(xù)發(fā)綠色熒光的重組瘧原蟲,可為我們研究瘧原蟲在蚊體內(nèi)的發(fā)育提供更加直觀的模型,然而可能由于外源基因的插入,構(gòu)建的重組約氏瘧原蟲BY265-GFP株對(duì)斯氏按蚊的感染率和感染度卻較低,從而影響了此模型在科學(xué)研究中的應(yīng)用。鑒此,本研究在加飼聯(lián)合抗生素的情況下,分別觀察了對(duì)斯氏按蚊中腸感染率和感染度、唾液腺子孢子數(shù)量的影響,以優(yōu)化重組約氏瘧原蟲BY265-GFP株/斯氏按蚊模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),抗生素對(duì)斯氏按蚊感染重組約氏瘧原蟲BY265-GFP株的卵囊和子孢子形成的影響明顯。我們認(rèn)為適當(dāng)?shù)募语暱股啬芴岣咚故习次脤?duì)重組約氏瘧原蟲BY265—GFP株的感染率,有助于對(duì)這一模型更好的應(yīng)用,并為進(jìn)一步研究瘧原蟲在宿主體內(nèi)的發(fā)育和感染提供依據(jù)。

[1]付雍,丁艷,周桃莉.蚊期和紅內(nèi)期持續(xù)表達(dá)綠色熒光蛋白的重組約氏瘧原蟲[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2009,27(6):488-491.

[2]Pacheco ND,Strome CP,Mitchell F,et al.Beaudoin.1979.Rapid,large-scale isolation of Plasmodium berg hei sporozoites from infected mosquitoes.J.Parasitol,1979,65(3):414-417.

[3]Blanford S,Read AF,Thomas MB.Thermal behaviour of A-nopheles stephensi in response to infection with malaria and fungal entomopathogens[J].Malar J,2009,8:72.

[4]楊松,黃復(fù)生,段建華.斯氏按蚊絲氨酸蛋白酶基因克隆及其與約氏瘧原蟲卵囊黑化關(guān)系的研究[J].中國(guó)人獸共患病雜志,2005,12(21):1059-1063.

[5]Zhang J,Huang FS,Xu WY,et al.Plasmodium yoelii:Correlation of up-regulated Prophenoloxidase and Phenoloxidases with melanization induced by the antimalarial,nitroquine[J].Experimental Parasitology,2008,118(3):308-314.

[6]Zhang J,Huang FS,Xu WY,et al.Plasmodium yoelii:correlation of TEP1 with mosquito melanization induced by nitroquine[J].Experimental Parasitology,2011,127(1):52-57.

[7]張健,徐文岳,段建華.按蚊 TEP1基因與硝喹誘導(dǎo)瘧原蟲卵囊黑化反應(yīng)的相關(guān)性[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2009,4(27):322-325.

[8]Suneja A,Gulia M,Gakhar SK.Blocking of malaria parasite development in mosquito and fecundity reduction by midgut antibodies in Anopheles stephensi(Diptera:Culicidae)[J].Arch Insect Biochem Phy siol,2003,52(2):63-70.

[9]Gakhar SK,Suneja A,Adak T.Midgut antibodies reduce the reproductive capacity of Anopheles stephensi(Diptera:Culicidae)[J].Indian J Exp Biol,2005,43(4):330-334.

[10]魏秋芬,曾令娥,孫寶清.抗斯氏按蚊中腸蛋白組分的抗體對(duì)約氏瘧原蟲卵囊的作用[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2006,24(6):441-444.