王艷艷,張健,徐文岳,段建華,黃復(fù)生

(第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病原生物學(xué)教研室,重慶 400038)

瘧疾是世界上危害最為嚴(yán)重的三大傳染病之一,瘧疾危及世界人口的40%。該病每年感染1億多人并造成80多萬人死亡(WH0,2009)。在我國瘧疾也影響和威脅著人們的健康,尤其是近年來全國發(fā)生輸入性瘧的地區(qū)呈逐年增加。目前的抗瘧藥主要著眼于對瘧原蟲的作用及其機制研究,極少關(guān)注抗瘧藥能否影響蚊期免疫并抑制或促進(jìn)蚊體內(nèi)瘧原蟲的發(fā)育。在瘧疾流行地區(qū),青蒿素聯(lián)合藥物已經(jīng)作為殺紅內(nèi)期第一線藥物治療瘧疾患者[1],其中蒿甲醚應(yīng)用比較廣泛。蒿甲醚是否會通過類似調(diào)節(jié)哺乳動物的方式調(diào)解按蚊的免疫反應(yīng),從而影響瘧原蟲在蚊期的發(fā)育[2-4]。如果抗瘧藥在發(fā)揮瘧疾治療和預(yù)防作用的前提下,又能阻斷按蚊傳播瘧原蟲,從控制傳染源這一環(huán)節(jié)切斷、控制傳播途徑,將不失為一種理想的防治手段。

利用斯氏按蚊-約氏瘧原蟲模型,通過飼喂蒿甲醚糖水的方法,觀察蒿甲醚是否能夠影響約氏瘧原蟲在斯氏按蚊體內(nèi)的發(fā)育。通過 RT-PCR分析 NOS、TEP1和 PPO三個斯氏按蚊重要的免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)變化,不僅為這些藥物現(xiàn)場使用提供參考依據(jù),而且可能為將來控制瘧疾媒介傳播提供了新思路。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

斯氏按蚊(Anophelesstephensi)(為我室長期繁殖、飼養(yǎng)的Hor株);約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii)(BY265株);小鼠(昆明株小鼠由本校實驗動物中心提供,體重16～20 g)。

1.2 蒿甲醚對約氏瘧原蟲在斯氏按蚊體內(nèi)發(fā)育的影響

1.2.1 蚊媒分組 將3-5日齡雌斯氏按蚊分為:感染瘧原蟲給蒿甲醚組(H):按常規(guī)腹腔接種健康小鼠,3 d后,選擇4只含有一定數(shù)量配子體的小鼠為供血鼠,供大劣按蚊吸血約2 h,將飽血雌蚊移出,感染后24 h,給632 ng/ml[5]蒿甲醚糖水1 d,常規(guī)飼養(yǎng);感染瘧原蟲組(G):按常規(guī)腹腔接種健康小鼠,3 d后,選擇4只含有一定數(shù)量配子體的小鼠為供血鼠,供大劣按蚊吸血約2 h,將飽血雌蚊移出,常規(guī)飼養(yǎng);吸正常血給蒿甲醚組(Hz):大劣按蚊吸正常小鼠血約2 h,將飽血雌蚊移出,感染后24 h,給637 ng/ml蒿甲醚糖水1d,常規(guī)飼養(yǎng);吸正常血未給藥組(Z):大劣按蚊吸正常小鼠血約2 h,將飽血雌蚊移出,常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2 蚊胃感染情況 感染后7 d,兩組解剖25-26只斯氏按蚊,在顯微鏡下觀察卵囊發(fā)育情況。

1.2.3 統(tǒng)計分析 采用GraphPad Prism 5 Portable軟件(V5.00)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,應(yīng)用t檢驗法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3 RT-PCR檢測給蒿甲醚后24 h,對斯氏按蚊中腸4個免疫基因在瘧原蟲感染條件下的變化

1.3.1 蚊胃總RNA的提取 感染后2 d,4組分別乙醚25支雌斯氏按蚊,在解剖顯微鏡下解剖蚊胃,將蚊胃置于冰預(yù)冷的勻漿器(氯仿處理)內(nèi),加入1 ml T ripure充分冰浴研磨,將裂解液置于氯仿處理的1.5 ml的 EP管內(nèi);劇烈震蕩5 min,室溫放置5 min,使樣本充分裂解。加入0.2 ml氯仿,劇烈振蕩15 sec,室溫靜置10 min;4℃12 000 g離心15 min,小心吸取無色上清移至新管,不要觸及蛋白層,加入0.5 ml異丙醇,室溫靜置5～10 min;4℃ 12 000 g離心10 min,去上清,沉淀加入 1 ml 75%乙醇;4℃ 7 500 g離心5 min洗滌沉淀,去上清,空氣風(fēng)干;用適量的DEPC水溶解總RNA,測定總RNA的純度和濃度;-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 離心法收集斯氏按蚊血淋巴和總RNA的提取 感染后2 d,4組分別冷凍麻醉100支雌斯氏按蚊,在解剖顯微鏡下用解剖針?biāo)洪_腹部后兩節(jié),將蚊蟲置于冰預(yù)冷、管蓋和管底部已用18號針頭打了孔的0.5 ml EP管中,每管25只雌斯氏按蚊,然后將0.5 ml EP管放入含100 μ L T ripure的1.5 Ml EP管中,4℃375×g離心10 min。按照試劑盒說明提取斯氏按蚊血淋巴總RNA(同1.3.1)。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 在0.5 ml EP管中加入以下試劑:5 ×PrimeScriptTMBuffer,2 μ l;Oligo dT Primer,0.5 μ l;Ramdom 6mers,0.5 μ l;PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I,0.5 μ l;總 RNA,700 μ g;RNase Free dH2O 補足至 10 μ l,混勻后,37℃,30 min,85℃,5 sec。

1.3.4 引物設(shè)計 根據(jù)斯氏按蚊AsNOS、AsTEP1和As-PPO序列和斯氏按蚊核糖蛋白S7(AsS7)序列(GeneBank accession number:AY583529、 AF53991、 EF076041、AF062034)。AsTEP1 特異 引物 F:5′-CCTCCCACAGACCAAACGA-3′,AsTEP1 特異 引物 F:5′-ATCGGT TCCGCCAACAAG-3′;AsPPO 特 異 引 物 F:5′-TGTTCCCCGACTCGTTTGT-3′,AsPPO 特異引 物 F:5′-CCCGTGATAGTTGCCGTAG-3′;AsNOS 特 異 引 物 F:5′-CATGCGTGGTAGTGGCGTTGC-3′,AsNOS 特 異 引 物 F:5′-GGCGTGATGAT TGGCTTCTGG-3′;AdS7 特異引物 F:5′-CTAACGACACGAAGACCACAAGA-3′,AdS7 特 異 引 物R:5′-CAACCTGCAACGAAGCAAAA-3′,引 物由 上海 英 駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3.5 PCR反應(yīng) 分別在0.5 ml EP管中按下表建立PCR反應(yīng)體系 :cDNA 模板 ,1 μ l;引物 F(10 pmol/μ l),0.5 μ l;引物 R(10 pmol/μ l),0.5 μ l;2.5 mM dNTPs,1 μ l;5×PCR buffer,5 μ l;GoTaq,0.25 μ l;ddH2O,18.75 μ l總體積 25 μ l。PCR反應(yīng)條件:斯氏按蚊S7,反應(yīng)條件:95℃2 min;95℃40 sec,45℃40 sec,72℃40 sec,27個循環(huán);72℃5 min;AsTEP1條件:95℃2 min;95℃40 sec,50℃40 sec,72℃40 sec,30個循環(huán);72℃5 min;AsPPO條件:95℃2 min;95℃40 sec,55℃40 sec,72℃40 sec,30個循環(huán);72℃5 min;AsNOS條件:95℃2 min;95℃40 sec,53℃40 sec,72℃40 sec,30個循環(huán);72℃5 min。

1.3.6 電泳分析 配制1×TAE電泳緩沖液和1.0%瓊脂糖凝膠50 ml,取5μ l PCR反應(yīng)物加入點樣孔內(nèi),100V電泳20 min,電泳完畢照相保存。

2 結(jié)果

2.1 蒿甲醚對約氏瘧原蟲在斯氏按蚊體內(nèi)發(fā)育的影響

圖1顯示瘧原蟲感染后7 d蚊胃,圖1-A顯示了感染瘧原蟲7 d,正常感染組按蚊蚊胃卵囊發(fā)育情況;圖1-B顯示感染給蒿甲醚組按蚊蚊胃卵囊發(fā)育情況,兩組比較給蒿甲醚組蚊胃中卵囊發(fā)育情況明顯優(yōu)于正常感染組卵囊發(fā)育;如圖1-C所示,感染組斯氏按蚊(26只)蚊胃平均感染度為 44.0,蒿甲醚感染組斯氏按蚊(25只)蚊胃平均感染度為171.5,顯示感染給蒿甲醚組按蚊感染度明顯高于正常感染組(P＜0.0001),卵囊數(shù)量增加3-5倍,說明蒿甲醚可以有效地促進(jìn)約氏瘧原蟲在斯氏按蚊體內(nèi)的發(fā)育。

圖1 感染后7 d,斯氏按蚊蚊胃BY265瘧原蟲株卵囊發(fā)育情況及感染度(100×)Fig.1 7d post infection,the infection of Anopheles stephensi infected BY265 Plasmodium yoelii(100×)

圖2 斯氏按蚊NOS,TEP1和PPO cDNA轉(zhuǎn)錄變化Fig.2 TranscriptvariationofAsNOS,AsTEP1and AsPPO cDNA

2.2 RT-PCR檢測給蒿甲醚24 h后,斯氏按蚊 NOS、TEP1和PPO3個免疫基因轉(zhuǎn)錄變化

蒿甲醚對四組斯氏按蚊3個NOS、TEP1和PPO免疫基因表達(dá)影響,半定量PCR檢測如圖2所示:通過對Z組和Hz組按蚊NOS、TEP1和PPO 3個免疫相關(guān)基因的條帶亮度比較,顯示Hz組的3個基因的條帶亮度明顯暗于Z組的基因條帶亮度,說明在無瘧原蟲感染條件下,蒿甲醚明顯抑制按蚊NOS基因的表達(dá);通過對G組和H組按蚊NOS、T EP1和PP 3個基因的條帶亮度比較,顯示H組的3個基因的條帶亮度明顯弱于G組的基因條帶亮度,說明在瘧原蟲感染條件下,蒿甲醚也會明顯抑制斯氏按蚊NOS、TEP1和PPO基因的表達(dá),提示蒿甲醚可以下調(diào)按蚊免疫基因的表達(dá),抑制其免疫系統(tǒng),降低按蚊對外界病原生物的抵抗力。

3 討論

在瘧疾流行地區(qū),青蒿素聯(lián)合藥物已經(jīng)作為第一線殺紅內(nèi)期抗瘧藥物,其中蒿甲醚應(yīng)用比較廣泛[1,5]。蒿甲醚為青蒿素的衍生物,對瘧原蟲紅內(nèi)期有強大且快速的殺滅作用,能迅速控制臨床發(fā)作及癥狀。本實驗結(jié)果顯示蒿甲醚與氯喹一樣可以促進(jìn)瘧原蟲在按蚊體內(nèi)的發(fā)育,使卵囊數(shù)量增加3-5倍,并通過調(diào)節(jié)免疫基因的表達(dá),從而影響按蚊免疫反應(yīng)。蒿甲醚是通過下調(diào) NOS、TEP1和PPO轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)揮了其抑制按蚊免疫系統(tǒng)的作用。而氯喹則是通過下調(diào)Sp14D2、AgSP24D、ISPL5、1644280 絲氨酸蛋白酶和 gambicin、defensin and cecropin抗菌肽的表達(dá),影響按蚊的絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)和抗菌肽的合成,降低按蚊免疫反應(yīng),促進(jìn)瘧原蟲在蚊體內(nèi)的發(fā)育[7,8]。

瘧原蟲感染可以按蚊激活insulin-responsive PI3-K/Akt和DSOR1/ERK信號通路,誘導(dǎo)NOS基因的表達(dá)上調(diào),使NO產(chǎn)物量增加對瘧原蟲產(chǎn)生殺傷作用,抑制瘧原蟲在按蚊體內(nèi)的發(fā)育[4]。蒿甲醚可能是通過抑制insulin-responsive PI3-K/Akt和DSOR1/ERK信號通路,下調(diào)NOS基因的表達(dá),抑制NO合成[4,5],致使斯氏按蚊對瘧原蟲免疫反應(yīng)減弱,促進(jìn)瘧原蟲在按蚊體內(nèi)更好的發(fā)育。PPO是黑化包被反應(yīng)中重要的效應(yīng)分子[8-11]。蒿甲醚可以下調(diào)PPO基因的表達(dá),蒿甲醚可能是通過抑制絲氨酸蛋白級聯(lián)反應(yīng),下調(diào)PPO基因的表達(dá),抑制黑化包被反應(yīng),降低斯氏按蚊對瘧原蟲的防御反應(yīng),促進(jìn)瘧原蟲在斯氏按蚊體內(nèi)的發(fā)育。

TEP1與哺乳動物的補體因子C3、C4以及α巨球蛋白(α2-Ms)都具有高度的同源性[12]。TEP1不但參與了機體對瘧原蟲的識別,還能對瘧原蟲有直接殺傷作用,作為補體樣因子,可以識別并結(jié)合瘧原蟲,與LRIM1和APL1共價結(jié)合形成類似膜攻擊復(fù)合物直接殺死瘧原蟲[14,15],NF-kB依賴的信號通路可以調(diào)節(jié)免疫關(guān)鍵因子TEP1的表達(dá)[14]。蒿甲醚可以下調(diào)T EP1的表達(dá),這可能是通過抑制NF-kB依賴信號通路,下調(diào)了TEP1的表達(dá),間接降低其對瘧原蟲的識別殺傷作用,促進(jìn)瘧原蟲的發(fā)育。

蒿甲醚作為青蒿素的衍生物,廣泛應(yīng)用于臨床和現(xiàn)場殺紅內(nèi)期藥物治療,非常有效。我們通過鼠瘧模型,根據(jù)生物等效設(shè)計、臨床或者現(xiàn)場使用劑量血藥高峰值換算給予按蚊吸飼的蒿甲醚劑量,觀察其對蚊期瘧原蟲發(fā)育的影響。研究結(jié)果提示蒿甲醚可以促進(jìn)蚊期瘧原蟲的發(fā)育,提示我們流行區(qū)里接受蒿甲醚治療的病人感染力非常高,按蚊叮刺蒿甲醚治療的病人血后將會大大增加瘧疾傳播的幾率,有利于瘧疾的流行和擴散。這對如何控制瘧疾流行、媒介傳播提出了新的問題,也為如何合理使用青蒿素類殺紅內(nèi)期藥物提出了新的研究課題。除了聯(lián)合用藥多種配方避免或延緩青蒿素類藥物產(chǎn)生抗藥性外,還要考慮如何降低瘧原蟲對媒介的易感性,阻斷其傳播。

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