王燕 褚漢啟 周良強 陳金 李志勇 劉云 張平 王春芳 黃孝文 崔永華

1 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(武漢430030);△現(xiàn)在武漢市婦幼兒童保健中心(武漢市兒童醫(yī)院)耳鼻咽喉頭頸外科

研究表明血管紋區(qū)域是轉(zhuǎn)運K+進入內(nèi)淋巴和產(chǎn)生耳蝸內(nèi)電位的重要部位[1,2],其中最主要的功能活性細胞邊緣細胞(marginal cell,MC)是內(nèi)淋巴產(chǎn)生和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵,并參與了蝸內(nèi)電位的形成和維持。KCNQ1為近年研究發(fā)現(xiàn)的分布于血管紋邊緣細胞膜上的三種轉(zhuǎn)運K+的通道蛋白之一[1～3],已發(fā)現(xiàn)該通道蛋白功能異常與多種心律失常、遺傳性聾等疾病的發(fā)生有關(guān)[4],其在耳蝸內(nèi)主要分布于邊緣細胞,除參與并維持耳蝸K+循環(huán)的作用外[5],亦可認為是邊緣細胞的特異性標(biāo)志蛋白。由于內(nèi)耳結(jié)構(gòu)復(fù)雜及血管紋邊緣細胞包裹于骨性蝸殼中,取材困難,所以邊緣細胞在內(nèi)耳聽力相關(guān)性疾病中的病理生理作用尚不清楚。本實驗采用原代消化培養(yǎng)方法,建立成年小鼠血管紋邊緣細胞體外分離培養(yǎng)體系,為進一步研究成年期邊緣細胞的生理特性、病理生理功能以及相關(guān)通道蛋白在耳蝸內(nèi)電位(endocochlear potential,EP)形成及K+循環(huán)中的作用和地位提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生75±3 d的健康C57BL/6J小鼠6只,體重30～35 g,雌雄不限,購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.2 實驗試劑 MEM培養(yǎng)基(Hyclone)中加入15%胎牛血清(Gibco)、氫化可的松0.4 mg/L(Sigma)、表皮生長因子10 ng/ml(Chenkon)、0.02%EDTA 、0.25%胰蛋白酶(Gibco)、膠原酶Ⅱ(invitrogen)。多聚賴氨酸(Sigma),兔抗小鼠角蛋白18(CK18)單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),兔抗小鼠KCNQ1多克隆抗體(Santa Cruz),羊抗兔IgG(SABC-cy3)試劑盒,羊抗兔IgG(SABC-FITC)試劑盒(武漢博士德)。Trizol(Invitrogen),RT-PCR試劑盒(Takara),CK18、KCNQ1及內(nèi)參β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 血管紋邊緣細胞的分離、純化與培養(yǎng) 6只成年小鼠采用頸椎脫臼法處死,浸入裝有75%乙醇的燒杯中消毒5 min,移入冰凍PBS液中進行解剖：斷頭,沿中線剪開顱骨,去除大腦及周圍組織,分離出雙側(cè)聽泡。在解剖顯微鏡下,分離出血管紋組織,將其剪成小塊狀轉(zhuǎn)移至離心管,加入0.2%Ⅱ型膠原酶于37℃培養(yǎng)箱消化30 min,然后 800 r/min離心5 min,棄上清,沉淀重懸于含15%胎中血清(FBS)的MEM 培養(yǎng)基中,收集細胞懸液轉(zhuǎn)移至用多聚賴氨酸預(yù)先包被的六孔板中,加入適量完全培養(yǎng)基,置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。24 h后換液,以后每2天或視細胞生長情況換液。每天用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)和生長的基本情況。采用選擇性消化法和差速貼壁法進行細胞純化[6,7]。

1.3.2 細胞生長曲線的測定 將細胞以每孔5×103個細胞接種于多聚賴氨酸包被的96孔細胞培養(yǎng)板中,每孔體積200 μ l,置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第1～15天隔日加入MT T溶液(5 g/L)20 μ l,37℃繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基,每孔加入 150 μ l DMSO,振蕩 10 min 后,以492 nm波長在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度(A)值。每組設(shè) 3個復(fù)孔,重復(fù)3次,以不加細胞僅加培養(yǎng)基的孔為空白對照孔。以時間為橫軸,A值均值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.4 培養(yǎng)細胞的鑒定

1.4.1 透射電鏡觀察 取純化后的細胞以0.25%胰蛋白酶消化,完全培養(yǎng)基終止消化,收集細胞懸液,800 r/min離心5 min,棄上清,2.5%戊二醛固定,常規(guī)制作透射電鏡標(biāo)本并觀察。

1.4.2 免疫熒光細胞化學(xué)檢測細胞角蛋白18(CK18)和KCNQ1的表達 取純化后的細胞爬片,4%多聚甲醛固定30 min,0.01 mol/L PBS溶液洗3 min×3次;0.25%tritonⅩ-100破膜 15 min,5%BSA封閉 20 min,分別加 CK18(1∶100)、KCNQ1(1∶200)抗體,4℃濕盒過夜,室溫復(fù)溫30 min,PBS洗 3 min×3次,分別滴加cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶100),FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶100),室溫孵育60 min,PBS洗3 min×3次,DAPI染核,防淬滅劑封片,激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。PBS代替一抗作陰性對照。

1.4.3 RT-PCR檢測CK18和KCNQ1 mRNA的表達 取純化后MC,PBS清洗去除培養(yǎng)液,按Trizol試劑盒說明提取細胞總RNA,再逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,進行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系(20 μ l)：cDNA 1 μ l,Taq Mix 10 μ l,超純水7 μ l,上游引物 1 μ l,下游引物 1 μ l。CK18 的上游引物 ：5′-GATCAGGCAGCTGAGGACAGA-3′;下游引物：5′-TGAGCT TGGAGACCT TGGAT-3′,擴增產(chǎn)物大小為235 bp;KCNQ1擴增的上游引物：5′-CGTGTACCACTTCACCGTCT T-3′,下游引物：5′-GAGGCGGACCACATATTCTG-3′,擴增產(chǎn)物大小為 157 bp;內(nèi)參β-actin基因,上游引物 ：5′-CCGTGAAAAGATGACCCAG-3′,下游引物 ：5′-TAGCCACGCTCGGTCAGG-3′,擴增產(chǎn)物大小為249 bp。擴增條件為：94℃預(yù)變性10 min,94℃變性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸1 min,共循環(huán)30次,72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察拍照,打印。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)的MC生長特性和形態(tài)特點 培養(yǎng)24～48 h后,在倒置顯微鏡下可見有細胞貼壁和增殖,呈不規(guī)則多角形,形成大小不等的“細胞島”(圖1);5～8天后,多角形細胞迅速生長,增殖快,以后逐漸進入平臺期,少量成纖維樣細胞在其外周生長;12～14天時大量增殖的細胞互相抵觸,緊密排列,形成上皮單層,呈上皮細胞典型的“鋪路石”樣外觀(圖2),并可見由數(shù)百個 MC密集生長組成的折光性強的球形結(jié)構(gòu)(dome);在培養(yǎng)第20天左右,細胞出現(xiàn)拉絲、拉網(wǎng)現(xiàn)象,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡。MC的生長曲線見圖3。

2.2 培養(yǎng)細胞的電鏡觀察及KCNQ1通道蛋白的的表達情況 透射電鏡觀察可見細胞胞漿內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器豐富,單核,呈卵圓形并可見分葉,細胞表面有較多微絨毛,細胞間連接緊密,符合上皮細胞特征(圖4);激光共聚焦檢測顯示培養(yǎng)的細胞CK18蛋白表達陽性(圖5),細胞胞質(zhì)可見紅色熒光,細胞核呈藍色;KCNQ1通道蛋白表達于細胞膜上,呈綠色熒光(圖6);陰性對照細胞無著色,僅見藍色細胞核;對培養(yǎng)細胞提取總RNA,OD260/OD280的比值為1.75,RT-PCR的產(chǎn)物：CK18為235 bp的片段,KCNQ1為157 bp的片段,β-actin為 249 bp(圖7、8)。

圖7 培養(yǎng)細胞的CK18mRNA RT-PCR電泳圖 M—marker;1-β-actin;2-CK18

圖8 培養(yǎng)細胞的KCNQ1mRNA RT-PCR電泳圖 M—marker;1-β-actin;2-KCNQ1

3 討論

耳蝸血管紋具有特殊的組織結(jié)構(gòu),血供豐富,由三層細胞和血管紋間隙(又稱紋間區(qū),intrastrial space,IS)組成,三層細胞分別為邊緣細胞(marginal cell,MC)、中間細胞(intermediate cell,IC)和基底細胞(basal cell,BC)。邊緣細胞緊鄰中階內(nèi)淋巴,以緊密連接蛋白相連接,不但參與K+向內(nèi)淋巴液的跨膜轉(zhuǎn)運,在形成內(nèi)淋巴高K+和維持耳蝸內(nèi)電位中起重要作用外,還參與內(nèi)外淋巴屏障的構(gòu)成。因邊緣細胞所在的血管紋位于耳蝸深處,且成年鼠耳蝸骨化明顯,血管紋分離取材更加困難,不利于對邊緣細胞的活體分離研究,而體外細胞培養(yǎng)可以克服這種缺點,故本研究采用Ⅱ型膠原酶消化法體外分離培養(yǎng)成年小鼠耳蝸血管紋邊緣細胞。

與其它實驗動物相比,小鼠是目前世界上用于研究轉(zhuǎn)基因和基因敲除最多的動物,尤其是敲基因和某些基因自然變異而導(dǎo)致的聽覺障礙與人類極為相似,因此小鼠逐漸替代豚鼠等實驗動物廣泛應(yīng)用于聽覺系統(tǒng)的研究。1989年Rarey等首先報道應(yīng)用消化法成功培養(yǎng)了牛的耳蝸血管紋邊緣細胞,此后,Kim等[8]報道用豚鼠、沙鼠和大鼠采用血管紋組織塊法培養(yǎng)出MC,并通過形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)和電生理學(xué)研究,初步觀察了培養(yǎng)的MC的結(jié)構(gòu)特征和功能特性,但未見小鼠血管紋邊緣細胞培養(yǎng)的報道。在組織水平對MC的在體研究發(fā)現(xiàn),不同年齡段邊緣細胞的某些功能蛋白的表達有差異,如Na、K-ATPase在小鼠耳蝸的表達于出生后1個月才達到成熟水平[9],且其活性隨著鼠齡增加而逐步減退[10],血管加壓素受體V2在成年大鼠耳蝸未檢測到其表達,而新生大鼠耳蝸則有表達[11]。本研究取材于成年小鼠,采用消化法建立耳蝸血管紋邊緣細胞培養(yǎng)體系,旨在為進一步研究成年期小鼠血管紋邊緣細胞的生理病理特性提供實驗細胞。

由于耳蝸血管紋組織分離的困難性,目前邊緣細胞的培養(yǎng)主要采用組織塊貼壁法和胰酶消化法,組織塊貼壁法雖操作簡單,但在邊緣細胞生長的同時,亦有較多的雜質(zhì)細胞如成纖維細胞、間質(zhì)細胞等生長,影響邊緣細胞的成長及純度;胰酶消化法是目前細胞培養(yǎng)研究中最常用的一種方法,但其消化作用較強,對細胞成分和活性的影響大[12]。而本研究選用Ⅱ型膠原酶進行血管紋邊緣細胞的原代消化培養(yǎng),其優(yōu)點在于Ⅱ型膠原酶作用溫和,有較好的細胞間質(zhì)消化功能,而上皮類細胞對其又具有一定的耐受性,可將上皮類細胞與細胞間質(zhì)成分相分離而不損傷上皮類細胞。國外很多學(xué)者在原代培養(yǎng)上皮細胞的研究中,均應(yīng)用了胰島素、霍亂毒素、三碘甲狀腺原氨酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子等成分促進細胞體外生長,但價格昂貴。本研究中僅使用了MEM、FBS、表皮生長因子成分,采用消化法仍培養(yǎng)出大量的MC,而且細胞代謝旺盛,生長良好,免疫熒光檢測可見培養(yǎng)細胞表達上皮細胞的標(biāo)志性蛋白CK18,且RT-PCR也檢測到培養(yǎng)的細胞表達CK18 mRNA,與其他研究者觀察到的邊緣細胞生長特點、結(jié)構(gòu)特征以及生物學(xué)特性一致,證實所培養(yǎng)的細胞為上皮來源的血管紋邊緣細胞。由于成纖維樣細胞相對較上皮類細胞容易貼壁[13],先吸附在瓶壁上,經(jīng)過多次貼壁選擇后,細胞懸液中剩下的主要是邊緣細胞,故在邊緣細胞的純化方面,本研究采用選擇性消化法和差速貼壁法,可使細胞的純度達到95%以上。

KCNQ1通道蛋白是一種電壓依賴性門控鉀通道蛋白,由位于染色體11p15.5的KCNQ1基因編碼,主要分布于內(nèi)耳、心臟、腎臟、胰腺和氣道等上皮細胞[5]。研究發(fā)現(xiàn)耳蝸KCNQ1通道可能是參與耳蝸K+循環(huán)的重要通道蛋白[14,15],可將邊緣細胞內(nèi)的K+分泌至內(nèi)淋巴,形成內(nèi)淋巴高K+環(huán)境。在耳蝸中KCNQ1通道僅表達于血管紋邊緣細胞的頂膜,是該膜的主要離子通道,因此可作為該細胞的獨特標(biāo)志物。若缺乏該通道將阻礙耳蝸血管紋轉(zhuǎn)運鉀離子進入內(nèi)淋巴,進而影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,最終造成聽力損失[16]。本實驗采用Ⅱ型膠原酶消化法成功建立了成年小鼠耳蝸血管紋MC的體外分離培養(yǎng)體系,有利于對成年小鼠耳蝸血管紋邊緣細胞進行病理、生理和分子生物學(xué)等方面的深入研究。

1 Weber PC,Cunningham CD,Schulte BA.Potassium recycling pathways in the human cochlea[J].Laryng oscope,2001,111：1 156.

2 Wangemann P.K+cycling and the endocochlear potential[J].Hearing Research,2002,165：1.

3 Wangemann P,Liu J,Marcus DC.Ion transport mechanism responsibal for K+secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro[J].Hearing Research,1995,84：19.

4 Jespersen T,Grunnet M,Olesen SP.The KCNQ1 potassium channel：From gene to phy siological function[J].Phy siology(Bethesda),2005,20：408.

5 Wangemann P.K+cycling and regulation in the cochlea and vestibular laby rinth[J].Audiol Neurootol,2002,7：199.

6 李雋,孔維佳,陳敏成,等.成年大鼠耳蝸血管紋緣細胞的體外培養(yǎng)[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2007,21：1 031.

7 司徒鎮(zhèn)強,吳軍正 .細胞培養(yǎng)[M].西安 ：世界圖書出版公司,2004.81～84.

8 Kim HN,Chang MS,Chung MH,et al.Establishment of primary cell culture from stria vascularis explants：Morphological and functional characterization[J].Acta Otolaryngol,1996,116：805.

9 Xia A,Kikuchi T,Hozawa K,et al.Expression of conne-xin26 and Na,K-ATPase in the developing mouse cochlea lateral wall：Functional implications[J].Brain Res,1999,846：106.

10 Gratton MA,Smyth BJ,Lam CF,et al.Decline in the endocochlear potential corresponds to decreased Na,K-ATPase activity in the lateral wall of quiet-aged gerbils[J].Hear Res,1997,108：9.

11 Furuta H,Luo L,Ry an AF,et al.Ex pression of mRNA encoding vasopressin V1a,vasopressin V2,and ANP2B receptors in the rat cochlea[J].Hear Res,1998,117：140.

12 陳超,李光輝,陳安民.含胎牛血清膠原酶消化法培養(yǎng)兔成骨細胞[J].中國矯形外科雜志,2004,12：0683.

13 Shibeshi W,Abraham G,Kneuer C,et al.Isolation and culture of primaryequine tracheal epithelial cells[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2008,44：179.

14 Schroeder B,Waldegger S,Fehr S,et al.A constituivery open potas-sium channel formal by KCNQ1 and KCNE3[J].Nature,2000,403：196.

15 Casimiro MC,Knollmann BC,Ebert SN,et al.Targeted disruption of the Kcnq1 gene produces a mouse model of Jervell and Lange-Nielsen syndrome[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98：25.

16 褚漢啟,熊浩,韓芳,等.KCNQ1在小鼠耳蝸血管紋的表達及在聽覺中的意義[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志,2007,15：303.