崔宇超，崔尚金

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室豬傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001）

生物技術(shù)是指應(yīng)用生命科學(xué)研究成果，以人們意志設(shè)計(jì)，對(duì)生物或生物的成分進(jìn)行改造和利用的技術(shù)?，F(xiàn)代生物技術(shù)定義更為廣泛，以分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、胚胎學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、生理學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等學(xué)科為支撐，結(jié)合了化學(xué)、化工、計(jì)算機(jī)、微電子等學(xué)科，從而形成了一門多學(xué)科互相滲透的綜合性學(xué)科，它可用于研究生命活動(dòng)的規(guī)律和提供產(chǎn)品為社會(huì)服務(wù)等。

現(xiàn)在，多種豬病嚴(yán)重威脅著我國的養(yǎng)豬業(yè)。自上世紀(jì)70年代以來，隨著多種原有傳染病流行的死灰復(fù)燃以及由于病原體的不斷變異并產(chǎn)生耐藥性，全球大約出現(xiàn)了近40種新發(fā)傳染病，再加上全球的城市化進(jìn)程加快、交通日益發(fā)達(dá)、氣候變暖以及人口老齡化等問題，導(dǎo)致傳染病在全球快速流行、復(fù)活頻率加快。多種傳染病的流行不僅未能得到有效預(yù)防和控制，反而更加猖獗。進(jìn)入21世紀(jì)后，以僅在數(shù)月內(nèi)就從發(fā)現(xiàn)到全國迅速傳播的藍(lán)耳病為標(biāo)志，新發(fā)和突發(fā)傳染病對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)的威脅在業(yè)界引起了更大的恐慌。此外，由于對(duì)自然資源過度開發(fā)而造成的自然生態(tài)環(huán)境失衡，加快了自然疫源性病原向人類的傳播速度，使人們不得不認(rèn)識(shí)到，過去5～10年才出現(xiàn)一種新傳染病，而今1～2年就有出現(xiàn)一種新傳染病的可能。在養(yǎng)殖業(yè)中經(jīng)常出現(xiàn)新的傳染病，不僅危害養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，也對(duì)人類構(gòu)成威脅。大規(guī)模暴發(fā)的傳染病不僅威脅人類健康，而且通過社會(huì)勞動(dòng)力的損失、勞動(dòng)成本的提高、產(chǎn)業(yè)的損失以及對(duì)貿(mào)易的影響和醫(yī)療負(fù)擔(dān)的加重等給社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重破壞，制約經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。20世紀(jì)以來在我國各地暴發(fā)的高致病性豬藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒感染等都使經(jīng)濟(jì)遭到巨大損失。以前人們可以通過臨床癥狀和病理學(xué)變化對(duì)豬病作出初診，但是確診一般要作血清學(xué)鑒定或病原分離鑒定。

目前，豬病多是混合感染，以前的技術(shù)手段就費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且難以應(yīng)對(duì)。在豬病的防治中，人們除了給藥、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、消毒、保持衛(wèi)生外，還可以通過接種疫苗來提高豬的抗病力，疫苗的發(fā)展也與現(xiàn)代生物技術(shù)密不可分。目前生物技術(shù)在豬病的診斷方面，可以用表達(dá)純化的抗原替代全病毒，敏感性、特異性都有巨大提高；在防治中可以用亞單位疫苗、或載體疫苗或者標(biāo)記疫苗，也可以用干擾素，起到的作用越來越大。以下簡單舉例說明生物技術(shù)在豬病的診斷和防治中的部分應(yīng)用。

1 生物技術(shù)在豬病診斷中的應(yīng)用

1.1 蛋白的克隆表達(dá)與純化技術(shù)

蛋白的克隆表達(dá)與純化技術(shù)目前已經(jīng)非常成功，診斷技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用純化抗原提供全病毒或者全細(xì)菌抗原，其創(chuàng)新優(yōu)點(diǎn)在于：1）突破了傳統(tǒng)的傳染性疾病診斷試劑盒生產(chǎn)過程中必須經(jīng)過病毒的細(xì)胞培養(yǎng)、病毒純化、抗原制備等繁瑣的生產(chǎn)模式，解決了傳統(tǒng)方式生產(chǎn)的抗原特異性不高、穩(wěn)定性差而且成本高的弊病，使得生產(chǎn)的抗原更穩(wěn)定，診斷方法也更可靠；2）選擇的是病原的免疫優(yōu)勢(shì)抗原基因作為表達(dá)對(duì)象，所以動(dòng)物在感染某一特定病原或者免疫該疾病的疫苗之后會(huì)產(chǎn)生比較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，因而提高了檢測(cè)技術(shù)的靈敏度，可以保證在臨床檢測(cè)過程中不會(huì)出現(xiàn)漏檢，加上采用基因工程技術(shù)可以獲得大量的純化的診斷抗原，有利于在臨床上普遍推廣和應(yīng)用；3）基因工程疫苗是當(dāng)前疫苗研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，采用生物工程技術(shù)生產(chǎn)疫苗已經(jīng)成為檢驗(yàn)一個(gè)國家科研實(shí)力的一個(gè)重要指標(biāo)，研制與開發(fā)高效新型的基因工程疫苗及其相應(yīng)的分子鑒別診斷試劑，將是未來產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。為了贏得這場(chǎng)戰(zhàn)爭的勝利，發(fā)達(dá)國家大都采用鼓勵(lì)發(fā)展、高額投入的策略，以美國為代表的西方發(fā)達(dá)國家的成功經(jīng)驗(yàn)是：“一種新疫苗的環(huán)境釋放，必須有其相應(yīng)的鑒別診斷方法，即配套的鑒別診斷試劑，以便從根本上消滅這種疾病”，其和傳統(tǒng)試劑盒比較優(yōu)點(diǎn)如表1。

表1 純化表達(dá)蛋白診斷試劑盒與傳統(tǒng)試劑盒比較

1.2 血清學(xué)試驗(yàn)

純化表達(dá)蛋白也可以應(yīng)用于膠體金試紙條，或者其他的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，如：

1.2.1 凝集試驗(yàn)

為細(xì)菌等顆粒性抗原（可用純化表達(dá)蛋白代替），或吸附在紅細(xì)胞、乳膠等顆粒性載體表面的可溶性抗原，與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時(shí)間，復(fù)合物互相凝聚形成肉眼可見的凝集團(tuán)塊。例如用玻片法作直接凝集試驗(yàn)進(jìn)行沙門氏菌、鏈球菌的鑒定，此法簡便快速，適用于新分離菌的鑒定或定型；利用紅細(xì)胞作載體進(jìn)行的間接血凝試驗(yàn)應(yīng)用于豬的病毒性傳染病、支原體病、寄生蟲病等的診斷與檢疫，例如豬氣喘病可以利用微量間接血凝試驗(yàn)作出診斷；以金黃色葡萄球菌為載體的協(xié)同凝集試驗(yàn)應(yīng)用于多種豬的細(xì)菌病和某些病毒病的快速診斷；應(yīng)用乳膠凝集試驗(yàn)診斷豬偽狂犬病，操作簡便，幾分鐘之內(nèi)便可得出試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 沉淀試驗(yàn)

為可溶性抗原如細(xì)菌的外毒素、內(nèi)毒素、菌體裂解液，病毒的可溶性抗原（可用純化表達(dá)蛋白代替）、血清、組織浸出液等與相應(yīng)的抗體結(jié)合，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時(shí)間，形成肉眼可見的白色沉淀。沉淀試驗(yàn)主要有環(huán)狀沉淀試驗(yàn)、免疫電泳技術(shù)和瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)。例如診斷炭疽的Ascoli試驗(yàn)；進(jìn)行鏈球菌血清型鑒定的環(huán)狀沉淀試驗(yàn)；應(yīng)用對(duì)流免疫電泳對(duì)豬傳染性水皰病等病毒病作出診斷；診斷豬傳染性胸膜肺炎的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

1.2.3 免疫標(biāo)記技術(shù)

是利用抗原（可用純化表達(dá)蛋白代替）、抗體反應(yīng)的特異性和標(biāo)記分子極易檢測(cè)的高度敏感性相結(jié)合形成的試驗(yàn)技術(shù)。免疫標(biāo)記技術(shù)主要有熒光抗體標(biāo)記技術(shù)、酶標(biāo)記抗體技術(shù)（ELISA）。例如豬流行性腹瀉在臨床上與豬傳染性腸胃炎十分相似，將患病小豬小腸冰凍切片，用豬流行性腹瀉病毒的特異性熒光抗體做直接免疫熒光檢查，即可對(duì)豬流行性腹瀉進(jìn)行確診；而藍(lán)耳病實(shí)驗(yàn)室診斷可通過間接免疫熒光檢查以確定病性；豬瘟的診斷可以通過單克隆抗體純化酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行確診；豬傳染性胃腸炎可以通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷；豬圓環(huán)病毒感染的檢出可用細(xì)胞培養(yǎng)的PCV2作為抗原，用PCV2特異性單克隆抗體作為競(jìng)爭試劑建立競(jìng)爭ELISA方法。

1.3 免疫膠體金試紙條

免疫膠體金技術(shù)因其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，在人類醫(yī)學(xué)上是一種常用的標(biāo)記技術(shù)。膠體金標(biāo)檢測(cè)顆粒是一種球形粒子，對(duì)蛋白質(zhì)具有很強(qiáng)的吸附功能，可與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素等以非共價(jià)結(jié)合。近年來人們利用這些特性將免疫膠體金技術(shù)引入生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，得到了日益廣泛的應(yīng)用。在免疫學(xué)中的應(yīng)用主要包括：在光鏡水平的應(yīng)用，在電鏡水平的應(yīng)用，凝集試驗(yàn)，免疫印記技術(shù)，斑點(diǎn)免疫金銀染色法，斑點(diǎn)金免疫滲濾測(cè)定法，膠體金免疫層析法等。免疫膠體金技術(shù)的起源可以追溯到1971年，F(xiàn)aulk WP和Taylor GM首先將兔抗沙門氏菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合，用直接免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌的表面抗原，標(biāo)志著膠體金作為標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于免疫學(xué)檢測(cè)研究。最近30多年來，免疫膠體金快速診斷技術(shù)因快速簡便，在人類醫(yī)學(xué)的臨床檢驗(yàn)和其他領(lǐng)域取得廣泛的應(yīng)用,如：妊娠試驗(yàn)、傳染病病原抗體的檢測(cè)、蛋白質(zhì)的檢測(cè)和藥物測(cè)定等。在動(dòng)物醫(yī)學(xué)方面最近3～5年也得到廣泛應(yīng)用，特別是在豬病診斷上的應(yīng)用。

隨著世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，豬病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害也隨之加劇。對(duì)豬病進(jìn)行有效防治的關(guān)鍵是快速準(zhǔn)確地進(jìn)行診斷并弄清致病因子。膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條具有簡便、準(zhǔn)確、快速和容易判定的特點(diǎn)，在豬病診斷上有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：①實(shí)際和樣本用量極小，樣本量可低至50～100 μL；②不需要計(jì)數(shù)器、熒光顯微鏡、酶標(biāo)檢測(cè)儀等貴重儀器，更適于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用；③沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)污染環(huán)境；④實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以長期保存；⑤檢測(cè)時(shí)間大大縮短，提高了檢測(cè)速度。金標(biāo)過程中，無共價(jià)鍵形成，是一定離子濃度下的物理吸附。因此，幾乎所有的大分子物質(zhì)都可被金標(biāo)記，標(biāo)記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膠體金的敏感性可達(dá)到ELISA的水平。尤其為一些基層獸醫(yī)站和養(yǎng)豬場(chǎng)的臨床檢測(cè)提供了非常好的條件。對(duì)指導(dǎo)免疫和建立適宜的免疫程序，可以收到很好的效果。以豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）為例簡介如下：

1.3.1 可應(yīng)用于抗體水平檢測(cè)

膠體金免疫層析快速診斷試紙條可應(yīng)用于豬病抗體水平的檢測(cè)，將PRRS的抗原或重組蛋白作為膠體金標(biāo)記結(jié)合蛋白和檢測(cè)帶，用來捕獲樣本中的相應(yīng)抗體，這種方法在實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)上都得到了廣泛的應(yīng)用。

1）當(dāng)母豬分娩時(shí)，用PRRS抗體免疫金標(biāo)試紙條檢測(cè)母豬的抗體水平。檢測(cè)結(jié)果：如果在試紙條上只出現(xiàn)一條色帶（C質(zhì)控帶），說明母豬體內(nèi)的PRRS抗體滴度低于抵抗PRRS強(qiáng)毒攻擊的最低保護(hù)抗體，母豬應(yīng)當(dāng)及時(shí)進(jìn)行PRRS疫苗接種，以免發(fā)生PRRS病。如果檢測(cè)出現(xiàn)2條色線，說明母豬體內(nèi)的PRRS抗體滴度較高，可以抵抗PRRS強(qiáng)毒的攻擊。

2）外購豬時(shí)，可用PRRS抗體免疫金標(biāo)試紙條檢測(cè)其是否免疫或免疫是否有效: 為了防止PRRS病發(fā)生，選擇什么時(shí)間再進(jìn)行PRRS免疫最適宜時(shí)，則可以根據(jù)不同地區(qū)，不同日齡的豬只，選擇有代表性的豬只采血，應(yīng)用豬PRRS抗體免疫金標(biāo)試紙條進(jìn)行快速檢測(cè)，通過檢測(cè)結(jié)果，可以了解整個(gè)豬群PRRS抗體的狀況來決定是否及時(shí)開展免疫及選擇適宜的免疫劑量，這樣可以大大地避免PRRS病的發(fā)生。

3）在懷疑發(fā)生PRRS時(shí)使用，可以采集病豬血液（血清）：用PRRS金標(biāo)檢測(cè)試紙檢測(cè)豬血液樣本，如果是發(fā)生PRRS病時(shí)，豬體血液中沒有PRRS抗體或抗體滴度很低。當(dāng)然，發(fā)生PRRS而耐過不死的豬只，抗體滴度可能會(huì)很高。

4）當(dāng)發(fā)生PRRS時(shí)常規(guī)的處理程序是全面隔離消毒和緊急預(yù)防注射。此時(shí)豬群特別是種豬場(chǎng)的豬群抗體滴度差異很大，當(dāng)緊急預(yù)防注射后的抗體滴度水平又會(huì)出現(xiàn)明顯的差異。因此，還是應(yīng)當(dāng)了解豬群的PRRS抗體水平，制定合理的免疫程序尤為重要。

1.3.2 抗原檢測(cè)

PRRS抗原免疫金標(biāo)試紙條可以快速檢測(cè)病毒抗原。將PRRS多克隆或單克隆抗體作為金標(biāo)結(jié)合蛋白和檢測(cè)帶，能夠捕獲樣本中的抗原，幾分鐘后就可見到檢測(cè)結(jié)果：檢測(cè)帶和質(zhì)控帶都變紅色。

1.3.3 檢測(cè)疫苗質(zhì)量

養(yǎng)豬專業(yè)戶或大型養(yǎng)豬場(chǎng)每年都必須從省生藥廠或各地獸醫(yī)站購買大批量的PRRS疫苗放在自己場(chǎng)里的冰箱凍結(jié)層內(nèi)。每次最好購買同一批號(hào)（一般以生產(chǎn)日期定批號(hào)）的PRRS疫苗?？梢詮闹腥〕鲆黄恳呙纾x擇不同日齡的乳豬、小豬、種豬若干頭，分別應(yīng)用2頭份，3頭份，4頭份，5頭份PRRS疫苗進(jìn)行免疫接種，免疫后15 d采血，用PRRS抗體免疫金標(biāo)試紙條測(cè)定抗體滴度，如果各組都能產(chǎn)生抵制PRRS強(qiáng)毒攻擊的免疫抗體時(shí)，則可以從中選擇免疫頭份少、抗體滴度高作為本批號(hào)疫苗最佳免疫劑量。如果檢測(cè)的PRRS抗體達(dá)不到強(qiáng)毒攻擊的最低保護(hù)抗體時(shí)，則應(yīng)當(dāng)檢查是否是疫苗本身問題，還是豬群存在有免疫抑制病毒（如圓環(huán)病毒）等的干擾。這時(shí)可以采取更換該廠家不同批號(hào)的PRRS疫苗或另選廠家的PRRS疫苗，再按上述方法進(jìn)行不同劑量免疫，來確定是否是疫苗失效或是免疫抑制病毒的干擾，判定適宜的免疫劑量。

1.3.4 可應(yīng)用于抗原水平檢測(cè)

目前，在國內(nèi)的豬病實(shí)驗(yàn)室診斷中，絕大部分依賴于抗體水平的檢測(cè)。即在豬只已患病一段時(shí)間或死亡后，取其樣品或病料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。這樣做可以了解豬的發(fā)病情況，和豬群體感染程度。但也有弊端：不能在病毒感染早期徹底消滅病毒，對(duì)豬群及時(shí)防疫。所以，及早發(fā)現(xiàn)感染病毒，有利于對(duì)感染豬進(jìn)行分離治療，避免大群患病所帶來的經(jīng)濟(jì)損失。

以雙抗體夾心法為例：以2種抗該病原的抗體分別用來包被NCM和標(biāo)記膠體金，如果樣品為陽性，則樣品中的病原分別和NCM上的抗體及金標(biāo)抗體結(jié)合，從而在NCM上檢測(cè)帶和質(zhì)控帶均呈現(xiàn)紅色，陰性則只有指控帶出現(xiàn)紅色。

1.3.5 可應(yīng)用多重檢測(cè)

由于膠體金免疫層析法不存在內(nèi)源酶干擾及放射性同位素污染等問題，且利用不同顆粒大小的膠體金還可以作雙重甚至多重標(biāo)記，使定位更加精確。能夠達(dá)到在一張?jiān)嚰垪l上同時(shí)檢測(cè)多種抗原或抗體，或者同一毒株的強(qiáng)弱毒抗體，很大程度上提高了檢測(cè)效率。但該方法均僅以膠體金顯色，需要較高濃度的標(biāo)記物，耗費(fèi)抗體或抗原的量較多，而且需要較大直徑的金顆粒（40～50 nm），才能獲得較高的靈敏度，而且當(dāng)金顆粒過大時(shí)，標(biāo)記物不穩(wěn)定，長期貯存容易發(fā)生自動(dòng)聚集。所以在國內(nèi)沒有得到廣泛地應(yīng)用。為了克服以上缺點(diǎn)，常常通過銀染加強(qiáng)顯色。

1.3.6 實(shí)現(xiàn)定量或半定量檢測(cè)

目前，根據(jù)顯色強(qiáng)度應(yīng)用簡單儀器進(jìn)行定量，在斑點(diǎn)免疫金滲濾方面已經(jīng)得到了初步應(yīng)用，在膠體金免疫層析上也有很好的發(fā)展前景：在膜上間隔一定距離包被上幾條平行的檢測(cè)帶，層析后觀察顯色帶的數(shù)量，從而把待測(cè)物含量確定于某一范圍。

可用反射光密度計(jì)對(duì)斑點(diǎn)顏色的強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，可得到半定量的結(jié)果；控制受體捕獲量：應(yīng)用多種不同靈敏度受體固定量的方式,通過觀察各自顯色情況,將待測(cè)物含量確定于某一濃度區(qū)間，以實(shí)現(xiàn)定量或半定量檢測(cè)。

1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，可用于疾病的診斷。例如豬圓環(huán)病毒感染的診斷可采用特異的引物通過病豬的組織、鼻腔分泌物和糞便進(jìn)行基因擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的限制酶切圖譜和堿基序列，確認(rèn)豬圓環(huán)病毒感染。

1.5 原位雜交試驗(yàn)

原位雜交試驗(yàn)（ISH）是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過程，使用DNA或者RNA探針來檢測(cè)與其互補(bǔ)的另一條鏈在細(xì)菌或其他真核細(xì)胞中的位置。例如豬圓環(huán)病毒感染的診斷應(yīng)用原位雜交試驗(yàn)，此法可以檢查豬圓環(huán)病毒的核酸，也可以精確定位豬圓環(huán)病毒在組織器官中的部位，可用于檢測(cè)臨診病料和作病理分析。

1.6 全基因測(cè)序技術(shù)及其他

全基因測(cè)序技術(shù)目前已經(jīng)非常成熟，可以快速鑒定一個(gè)未知病原。其他也有很多技術(shù)，如LAMP等，不再一一敘述。

2 生物技術(shù)在豬病防治中的應(yīng)用

2.1 亞單位疫苗

利用微生物的某種表面結(jié)構(gòu)成分（抗原）制成不含有核酸、能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體的疫苗，稱為亞單位疫苗。亞單位疫苗是將致病菌主要的保護(hù)性免疫原存在的組分制成的疫苗。目前已經(jīng)可以利用桿狀病毒或者酵母系統(tǒng)表達(dá)、純化制作亞單位疫苗，比較成功的例子是豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗和豬細(xì)小病毒亞單位疫苗。

2.2 活載體疫苗

2.2.1 復(fù)制性活載體疫苗

這類疫苗以某種非致病性病毒(株)或細(xì)菌為載體來攜帶并表達(dá)其他致病性病毒或細(xì)菌的保護(hù)性免疫抗原基因。即用基因工程方法，將一種病毒或細(xì)菌免疫相關(guān)基因整合到另一種載體病毒或細(xì)菌基因組DNA的非復(fù)制必需片段中構(gòu)成重組病毒或細(xì)菌，在被接種的動(dòng)物體內(nèi)，特定免疫基因可隨重組載體病毒或細(xì)菌的復(fù)制而適量表達(dá)，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫抗體。

1）病毒活載體疫苗常作為載體的病毒有痘苗病毒、腺病毒、偽狂犬病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒等，這里僅介紹常見的幾種病毒活載體疫苗。此疫苗具有常規(guī)疫苗的所有優(yōu)點(diǎn)，而且便于構(gòu)建多價(jià)疫苗，建立鑒別診斷方法。

2）細(xì)菌活載體疫苗是指將病原體的保護(hù)性抗原或表位插人已有細(xì)菌基因組或其質(zhì)粒的某些部位使其表達(dá)?；?qū)⒉≡w的保護(hù)性抗原或其表位在細(xì)菌的表面表達(dá)。目前主要有沙門氏菌活載體疫苗、大腸桿菌活載體疫苗、卡介苗活載體疫苗以及以單核細(xì)胞增多性李斯特菌和小腸結(jié)腸耶爾森氏菌為載體的其他細(xì)菌活載體疫苗。

在實(shí)驗(yàn)室條件下應(yīng)用得比較成功的這類基因工程疫苗有：能表達(dá)豬瘟病毒囊膜糖蛋白El的重組PRV(TK-)，能表達(dá)狂犬病囊膜糖蛋白的重組痘苗病毒等，能表達(dá)狂犬病囊膜糖蛋白的重組犬皰疹病毒等。不過，復(fù)制性活載體疫苗都有一個(gè)共同的缺陷，即畜禽體內(nèi)的抗載體病原的抗體會(huì)干擾或完全抑制活載體的復(fù)制，從而影響了插入基因的表達(dá)。因此，這類疫苗不能用于已有抗活載體抗體的畜禽和二次免疫。

2.2.2 非復(fù)制性活載體疫苗

這類基因工程疫苗的構(gòu)建方法與前一類復(fù)制性活載體疫苗相同，但選用的載體病毒不能在免疫接種動(dòng)物的體內(nèi)復(fù)制，是一種宿主限制性疫苗。不過，特定強(qiáng)毒的免疫原性基因仍能在接種動(dòng)物體內(nèi)少量表達(dá)，并足以刺激保護(hù)性免疫反應(yīng)。例如以金絲雀痘病毒(CPV)為載體表達(dá)狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因的重組病毒疫苗用來預(yù)防人和哺乳動(dòng)物的狂犬病(KV)，已在實(shí)驗(yàn)室中顯示出良好的免疫效果。

研制活病毒載體疫苗，必須注意人用疫苗和畜禽用疫苗的區(qū)別，人用疫苗的焦點(diǎn)是安全性，畜禽用疫苗除安全性外還要考慮成本效益。選擇理想的載體是活載體疫苗研制及應(yīng)用成功的關(guān)鍵。目前常用的有FPV載體疫苗，F(xiàn)PV是已知的最大的動(dòng)物病毒，基因組長達(dá)300 kb，可以容納大片段外源基因，是構(gòu)建多價(jià)或多聯(lián)疫苗的理想載體。除痘病毒外，皰疹病毒和腺病毒也被選作載體。皰疹病毒作為載體的優(yōu)點(diǎn)是：能刺激很強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答和強(qiáng)而持久的體液免疫應(yīng)答；基因組大，能容納較大的外源基因片段；特異宿主范圍窄，不像痘苗病毒那樣存在種間擴(kuò)散等問題。腺病毒也能引起好的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，在自然呼吸道感染情況下還能產(chǎn)生好的黏膜免疫應(yīng)答，腺病毒的特異宿主范圍也窄，這些都是用作疫苗載體的有利條件。研制腺病毒載體動(dòng)物疫苗的前景尤其誘人。以疫苗株沙門菌和卡介苗作為外源基因的載體己越來越引起研究者們的興趣。細(xì)菌載體本身具有佐劑的作用，能刺激產(chǎn)生強(qiáng)的B細(xì)胞和T細(xì)胞免疫應(yīng)答?？诜抽T菌還能刺激黏膜免疫，無須注射。因此，用它作載體更具吸引力。

活載體疫苗的研究非?；钴S，其優(yōu)點(diǎn)是：

活載體疫苗可同時(shí)啟動(dòng)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫，避免了滅活疫苗的免疫缺陷。

2)尤為重要的是活載體疫苗可以同時(shí)構(gòu)成多價(jià)以至多聯(lián)疫苗，既能降低生產(chǎn)成本，又能簡化免疫程序，還能克服不同病毒弱毒疫苗間產(chǎn)生的干擾現(xiàn)象。

3)疫苗用量少，免疫保護(hù)持續(xù)時(shí)間長、效果好，不須添加佐劑，降低了成本。

4)不影響該病的監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。然而其缺點(diǎn)是不能忽視的：Katz等的研究表明，豬PRV基因缺失疫苗株可與野生型強(qiáng)毒株進(jìn)行基因重組，從而使重組病毒毒力增強(qiáng)。而豬PRV基因缺失疫苗株和野生型強(qiáng)毒株均可在非靶動(dòng)物浣熊體內(nèi)存活并繁殖，這就為2個(gè)毒株間的基因重組，進(jìn)而導(dǎo)致毒力增強(qiáng)提供了先決條件。痘苗病毒能在哺乳動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制，而與天花病毒類似的痘苗病毒在動(dòng)物上應(yīng)用會(huì)進(jìn)化出對(duì)人類有致病性的新病毒，引起未種痘病毒疫苗人群感染，并使極少數(shù)感染者發(fā)病，因而重組痘病毒疫苗難以商品化?；钶d體疫苗在二次免疫時(shí)還會(huì)誘發(fā)針對(duì)載體的排斥反應(yīng)等。

2.3 建立健康豬群或者制備豬用干擾素

2.3.1 建立健康豬群

例如對(duì)豬偽狂犬病的防治無特效治療藥物，但可以建立健康豬群，在生物技術(shù)方面對(duì)豬群采血做血清中和試驗(yàn)，陽性者隔離，以后淘汰，以3～4周為間隔反復(fù)進(jìn)行，一直到2次試驗(yàn)全部為陰性為止；母豬產(chǎn)仔斷乳后，盡快分開，隔離飼養(yǎng)，每窩小豬均須與其他窩小豬隔離飼養(yǎng)，直到16周齡時(shí)，做血清學(xué)檢查，此時(shí)母源抗體轉(zhuǎn)為陰性，所有陽性豬淘汰，30 d后再做血清學(xué)檢查，把陰性豬合成較大群，最終建立新的無病豬群。

2.3.2 制備豬用干擾素

干擾素(interferon，IFN)最早是 1957年由英國科學(xué)家Alick Isaacs和 Iean Lindenmann在利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒干擾現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)，一類能干擾和抑制病毒復(fù)制的可溶性細(xì)胞分泌物?，F(xiàn)定義為：干擾素是在特定的誘導(dǎo)劑作用下，由細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有高度生物學(xué)活性的糖蛋白，當(dāng)它再作用于其他細(xì)胞時(shí)，使其他細(xì)胞立即獲得抗病毒和抗腫瘤等多方面的免疫力。近半個(gè)世紀(jì)以來，干擾素一直是免疫學(xué)、病毒學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。特別是近幾年來，隨著干擾素在一些畜禽病毒性疾病及腫瘤性疾病的治療方面取得良好療效，獸醫(yī)科研工作者越來越重視干擾素在動(dòng)物體內(nèi)的免疫特性及其臨床制品的研究。

目前，一般將干擾素分為 Ⅰ型和 Ⅱ型2類，幾乎所有脊椎動(dòng)物均可產(chǎn)生這2類干擾素。Ⅰ型干擾素主要包括α干擾素(IFN-α)和β干擾素(IFN -β)等，主要參與抗病毒、抗腫瘤作用；II型干擾素稱免疫干擾素，只包括γ干擾素(IFN -γ) ，主要參與誘導(dǎo)組織相容性抗原(MHC)的表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，但其抗病毒作用比Ⅰ型干擾素弱。

目前，基因工程方法表達(dá)目的蛋白主要有原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)，雖然原核表達(dá)具有易操作、表達(dá)量高等特點(diǎn)，但原核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白不能模擬病毒的天然蛋白結(jié)構(gòu)，由于其不能有效地進(jìn)行多肽鏈的折疊、二硫鍵的形成和翻譯后修飾，這在一定程度上限制了原核表達(dá)的應(yīng)用。真核表達(dá)雖然操作復(fù)雜、表達(dá)水平低、成本高，但能保證蛋白質(zhì)的正確修飾和復(fù)性，從而保證其生物活性。腺病毒是基因工程表達(dá)有效載體之一。我們利用腺病毒載體得到了α-豬重組白細(xì)胞干擾素后，每毫升內(nèi)含有干擾素不低于 1 000萬IU。通過實(shí)驗(yàn)室研究和小規(guī)模臨床試驗(yàn)，證明α-豬重組白細(xì)胞干擾素 用于豬瘟、藍(lán)耳病、偽狂犬病、水皰病、流感、傳染性胃腸炎、流行性腹瀉、輪狀病毒病等病毒性疾病以及病毒、細(xì)菌性混合感染的早期預(yù)防和治療。試驗(yàn)效果如下：

2.3.2.1 抗PRRSV的效果

1）rAd-pIFNα在Marc-145細(xì)胞上抑制PRRSV的增殖。

將Marc-145細(xì)胞種植在96孔或24孔細(xì)胞板中，待細(xì)胞密度長至80%左右時(shí)，每孔接種200MOI（感染復(fù)數(shù)）的rAd-pIFNα，37 ℃培養(yǎng)24 h后，每孔再接種100MOI的PRRSV；同時(shí)設(shè)立僅感染PRRSV的Marc-145細(xì)胞作為接毒對(duì)照以及正常細(xì)胞對(duì)照。

結(jié)果表明，rAd-pIFNα可以完全阻止細(xì)胞病變的產(chǎn)生，對(duì)照組有明顯的病變產(chǎn)生。免疫熒光染色表明，對(duì)照組均觀察到了大量感染PRRSV的細(xì)胞，而rAd-pIFNα處理組僅觀察到極少數(shù)的PRRSV感染細(xì)胞。表明，rAdpIFNα可以有效地抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞上的增殖（見圖1）。

2）PRRSV預(yù)先感染的Marc-145細(xì)胞可被rAd-pIFNα抑制。

將Marc-145細(xì)胞種植在96孔或24孔細(xì)胞板中，待細(xì)胞密度長至80%左右時(shí)，每孔Marc-145細(xì)胞感染100MOI的PRRSV，24 h后每孔再接種200MOI的rAd-pIFNα；同時(shí)設(shè)立僅感染PRRSV的Marc-145細(xì)胞作為接毒對(duì)照以及正常細(xì)胞對(duì)照。

圖1 rAd-pIFNα在Marc-145細(xì)胞上抑制PRRSV的增殖

圖2 PRRSV預(yù)先感染的Marc-145細(xì)胞可被rAd-pIFNα抑制

圖3 重組腺病毒rAd-pIFNα有明顯FMDV的效果

結(jié)果表明，接種rAd-pIFNα的細(xì)胞中的PRRSV的RNA水平顯著低于對(duì)照組（見圖2）。這些數(shù)據(jù)證明rAdpIFNα對(duì)感染了PRRSV之后也具有一定的治療作用。

2.3.2.2 抗FMDV的效果

將50TCID50的重組腺病毒 rAdpIFNα接種長滿單層的PK15細(xì)胞的24 孔板，每種病毒重復(fù)3個(gè)孔，37 ℃吸附1 h；去除未吸附的病毒，用DMEM洗滌2次后，每孔加入含2%新生牛血清的DMEM維持液0.5 mL；于24 h后取上清100 μL/孔；上清作適當(dāng)處理后，將 rAd-pIFNα的樣品作10倍比梯度稀釋后加至長滿單層的PK15細(xì)胞的96孔板，37 ℃孵育24 h；棄上清，感染100 TCID50的豬口蹄疫病毒，同時(shí)設(shè)立病毒感染細(xì)胞、正常細(xì)胞對(duì)照。培養(yǎng)3 d，觀察CPE。結(jié)果表明，重組腺病毒rAd-pIFNα接種的PK-15細(xì)胞產(chǎn)生的豬IFNα在稀釋100倍后，孵育PK-15細(xì)胞后有明顯的抗豬口蹄疫病毒活性，未產(chǎn)生CPE（見圖3）。

2.3.2.3 產(chǎn)品特點(diǎn)

1）目前市場(chǎng)上的干擾素產(chǎn)品大多為原核表達(dá)或酵母表達(dá)產(chǎn)品，其產(chǎn)物純化工藝復(fù)雜，而且與天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)存在較大差異。本產(chǎn)品利用缺陷型腺病毒載體進(jìn)行表達(dá)，可以模擬干擾素的正確空間結(jié)構(gòu)，以及進(jìn)行蛋白翻譯后的正確修飾，使表達(dá)產(chǎn)物具有正確的活性。

2）由于α-干擾素在體內(nèi)半衰期短，因而以腺病毒載體導(dǎo)入干擾素基因可以比直接投藥（原核表達(dá)或酵母表達(dá)產(chǎn)品）延長其在體內(nèi)持續(xù)作用時(shí)間，使藥效更長久，從而提高干擾素的作用效果。

3）抗病毒活性強(qiáng)。對(duì)豬瘟、藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒病、偽狂犬病、傳染性胃腸炎、流行性腹瀉、輪狀病毒等病毒都具有超強(qiáng)的抗病毒活性。

4）作用迅速。進(jìn)入機(jī)體后，5 min就可以使機(jī)體處于抗病毒狀態(tài)，1～2 h出現(xiàn)抗病毒蛋白，5 h達(dá)到高峰，并且在2～3周內(nèi)對(duì)病毒的重復(fù)感染有抵抗作用。

5）強(qiáng)力穿透作用，可直達(dá)已感染的細(xì)胞內(nèi)，對(duì)胞內(nèi)感染細(xì)菌也有抑制作用。

6）使用豬干擾素可與任何抗病毒類化藥和抗生素聯(lián)合應(yīng)用。

7)完全克服抗病毒藥物作用不準(zhǔn)確、副作用大，易產(chǎn)生耐藥性的缺點(diǎn)，無毒、無害、無殘留。

8)用法簡單。體重≤50 kg，0.5 mL/頭；體重≥50 kg，1.0 mL/頭。每頭每日肌肉注射1次；病重者每天可注射2次，連續(xù) 3～5 d為一個(gè)療程。預(yù)防劑量減半。