溫中明，李 東，徐玉紅

(1.廣東省深圳市光明新區(qū)公明人民醫(yī)院藥劑科，廣東 深圳 518106;2.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院·深圳市人民醫(yī)院臨床藥學(xué)室，廣東 深圳 518020;3.廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳福田人民醫(yī)院藥劑科，廣東 深圳 518033)

喹諾酮類藥物的殺菌效果呈濃度依賴性，濃度越高，抗菌活性越強(qiáng)，最大血藥濃度與最低抑菌濃度的比值(Cmax/MIC)大于8～10時(shí)，呈明顯殺菌活性，且可減少耐藥菌株的產(chǎn)生。但隨著濃度增加，藥物不良反應(yīng)明顯增加，對(duì)于某些特殊患者，抗菌藥物的血藥濃度監(jiān)測(cè)具有明顯的臨床意義。有關(guān)血樣中喹諾酮類藥物的含量測(cè)定方法報(bào)道很多[1－8]，但測(cè)定不同的喹諾酮類藥物，文獻(xiàn)報(bào)道所使用的儀器、色譜條件以及樣品處理方式各不相同，有些方法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備或技術(shù)要求較高，基層實(shí)驗(yàn)室難以滿足。為此，筆者建立了一種血樣處理相對(duì)簡(jiǎn)單、條件易于滿足、檢測(cè)靈敏度高的方法，可用于多種喹諾酮類藥物的測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀，包括G 1311 A四元泵，G 1322 A真空脫氣機(jī)，G 1315 B－DAD檢測(cè)器，D 1316 A柱溫箱，rheodyne－7725i進(jìn)樣器，ChemStation色譜工作站;AG 285型電子天平(梅特勒－托利多儀器有限公司);XW－80A型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);KQ 5200 DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);高速離心機(jī)(雅培公司);pHS－3C數(shù)字pH計(jì)(上海精科雷磁儀器廠)。氧氟沙星對(duì)照品、洛美沙星對(duì)照品、加替沙星對(duì)照品、司帕沙星對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;鹽酸莫西沙星對(duì)照品由拜耳醫(yī)藥保健有限公司提供;甲醇、乙腈為一級(jí)色譜純，均購(gòu)自天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司;水為注射用水，其他試劑為分析純。所有試液使用前均經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Kromasil C8柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(調(diào)pH至3.0)－甲醇－乙腈 (65∶20 ∶15);流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)依測(cè)定物進(jìn)行調(diào)整以提高檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)模型藥物莫西沙星時(shí)波長(zhǎng)設(shè)定為296 nm。在此條件下，氧氟沙星、洛美沙星、加替沙星、司帕沙星、莫西沙星均能依次得到分離，其中加替沙星和莫西沙星的保留時(shí)間分別約為5.8 min和7.6 min，理論板數(shù)按莫西沙星計(jì)算不低于8 000。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 人血漿中5種喹諾酮類抗菌藥物高效液相色譜圖

2.2 溶液配制

精密稱取干燥至恒重的各對(duì)照品10.0～20.0 mg，置10 mL量瓶中，以注射用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別得質(zhì)量濃度為1 000.0～2 000.0 μg/mL 的對(duì)照品貯備液，置 4 ℃冰箱中備用。莫西沙星對(duì)照品貯備液的質(zhì)量濃度為1 000.0 μg/mL，臨用時(shí)分別精密量取適量于10 mL量瓶中，以流動(dòng)相稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度分別為 2.5，5，10，20，40，80，160，250 μg/mL 的系列莫西沙星對(duì)照品工作液。加替沙星對(duì)照品貯備液的質(zhì)量濃度為1 000.0 μg/mL，作內(nèi)標(biāo)時(shí)的質(zhì)量濃度為20.0 μg/mL。精密稱取磷酸二氫鉀2.72 g，加適量蒸餾水溶解后加入10 mL三乙胺，邊加邊攪拌，以蒸餾水定容至1 000 mL，用分析純濃磷酸調(diào) pH至3.0，即得濃度為0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液。

2.3 血漿樣品預(yù)處理

將全血樣品4 mL置肝素抗凝管中，靜置30 min，以3 000 r/min離心10 min。取上清液，置1.5 mL離心管中，密封，標(biāo)記，－20℃保存至分析。分析前，血漿樣品于室溫下自然解凍后，精密吸取0.5 mL，置10 mL具塞錐形離心管中，加內(nèi)標(biāo)溶液適量，旋渦混合30 s，加入二氯甲烷5 mL，旋渦提取5 min，10 000 r/min離心10 min，取二氯甲烷層，50℃水浴氮?dú)饬鞔蹈桑瑲堅(jiān)?00 μL流動(dòng)相旋渦30 s溶解，再以10 000 r/min離心3 min后取20 μL進(jìn)樣。以加替沙星為內(nèi)標(biāo)測(cè)定模型藥物莫西沙星時(shí)，20.0 μg/mL的加替沙星內(nèi)標(biāo)溶液的加入量為 15 μL。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):分別取6名健康體檢者的混合空白血漿0.5 mL，按2.3項(xiàng)下操作，獲得空白血漿樣品的典型色譜圖1A;將不同質(zhì)量濃度的5種喹諾酮類藥物對(duì)照品溶液10 μL加入至0.5 mL混合空白血漿中，同法操作，獲得典型色譜圖1B。將一定質(zhì)量濃度莫西沙星對(duì)照品溶液10 μL加入0.5 mL混合空白血漿中得0.2 μg/mL莫西沙星對(duì)照品血樣，同法操作，獲得典型色譜圖1C;取健康受試者單劑量口服400 mg鹽酸莫西沙星片劑后12 h的血漿樣品，同法操作，得色譜圖1D。結(jié)果表明，在篩選出的樣品處理?xiàng)l件及色譜條件下，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及代謝物均不干擾樣品測(cè)定，峰形對(duì)稱性好，基線噪音小(圖1)。

線性范圍考察及檢測(cè)限:以莫西沙星為模型藥物，對(duì)方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證。取10 mL具塞錐形離心管9支，分別精確加入健康體檢者空白血漿0.5 mL，除空白管外，每支管精確加入不同質(zhì)量濃度的莫西沙星對(duì)照品工作液10 μL，渦旋混合30 s，使質(zhì)量濃度分別為0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.60，3.20，5.00 μg/mL，按 2.3 項(xiàng)下方法操作，分別記錄莫西沙星峰面積(As)及內(nèi)標(biāo)峰面積(Ai)，以莫西沙星與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(As/Ai)對(duì)莫西沙星質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 As/Ai=2.119 4 C －0.077 9(r=0.999 8)。結(jié)果表明，莫西沙星質(zhì)量濃度線性范圍是 0.05～5.00 μg/mL。莫西沙星的最低定量限為 0.05 μg/mL，檢測(cè)限為 0.015 μg/mL(RS/N=3)。

方法精密度:用空白血漿及對(duì)照品溶液配制質(zhì)量濃度為0.10，1.60，5.00 μg/mL 的 3 種莫西沙星質(zhì)控樣品，各 6 份，按 2.3 項(xiàng)下方法操作，于1 d內(nèi)各濃度重復(fù)測(cè)定6次;連續(xù)6 d，每天配制上述3種質(zhì)量濃度的莫西沙星樣品進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)定結(jié)果比值代入回歸方程，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 方法日內(nèi)及日間精密度試驗(yàn)結(jié)果(±s，n=6)

表1 方法日內(nèi)及日間精密度試驗(yàn)結(jié)果(±s，n=6)

質(zhì)量濃度(μg/mL)日內(nèi)精密度 日間精密度0.10 1.60 5.00測(cè)定濃度(μg/mL)0.11 ± 0.006 1.62 ± 0.065 4.96 ± 0.22 RSD(%)5.73 4.03 4.45測(cè)定濃度(μg/mL)0.11 ± 0.008 1.65 ± 0.07 5.02 ± 0.27 RSD(%)6.83 4.53 5.43

回收率:用空白血漿0.5 mL和莫西沙星對(duì)照品溶液適量，配制質(zhì)量濃度為 0.10，1.60，5.00 μg/mL 的 3 種莫西沙星質(zhì)控樣品，各6份，按2.3項(xiàng)下方法操作，測(cè)定。將莫西沙星與加替沙星峰面積比代入線性方程，計(jì)算質(zhì)量濃度，測(cè)定質(zhì)量濃度與加入質(zhì)量濃度的比值即為方法回收率。另取空白血漿0.5 mL，不加入莫西沙星及內(nèi)標(biāo)工作液，按2.3項(xiàng)下方法處理，在取二氯甲烷層后加入相同量的莫西沙星及內(nèi)標(biāo)工作液，旋渦30 s，同法吹干、溶解、測(cè)定。將提取后測(cè)得的峰面積與未提取測(cè)得的峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算提取回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 方法回收率和提取回收率試驗(yàn)結(jié)果(±s，n=6)

表2 方法回收率和提取回收率試驗(yàn)結(jié)果(±s，n=6)

質(zhì)量濃度(μg/mL)0.10 1.60 5.00測(cè)定質(zhì)量濃度(μg/mL)0.10 ±0.006 1.62 ±0.07 4.97 ±0.19方法回收率(%)104.50 ± 6.28 101.03 ± 4.63 99.37 ± 3.82提取回收率(%)80.48 ± 4.63 90.30 ± 4.63 91.25 ± 3.91

血漿樣品穩(wěn)定性:用空白血漿配制足夠量的質(zhì)量濃度為0.10，1.60，5.00 μg/mL 的莫西沙星樣品，立即按 2.3 項(xiàng)下方法處理、測(cè)定。在－20℃冰箱中冷凍24 h后取出，室溫解凍后，各取樣0.5 mL處理、測(cè)定。剩余血漿樣品再次放入－20℃冰箱中冷凍，24 h后解凍、處理、測(cè)定，重復(fù)凍融循環(huán)3次，考察血漿樣品凍融穩(wěn)定性。結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度的 RSD 分別為 5.27%，4.03%，5.25% ，顯示凍融條件對(duì)血漿樣品的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響。用空白血漿配制足量的質(zhì)量濃度為 0.10，1.60，5.00 μg/mL 的莫西沙星樣品，吸取各質(zhì)量濃度樣品1 mL，置1.5 mL離心管中，每個(gè)質(zhì)量濃度9份。其中5 份在室溫下放置 0，2，4，8，12 h 后按 2.3 項(xiàng)下方法處理、測(cè)定;另外4份分別在－20℃冰箱中保存1，2，4，12周后，再按2.3項(xiàng)下方法處理、測(cè)定。3個(gè)質(zhì)量濃度室溫下測(cè)定結(jié)果的 RSD為4.18% ～5.77%，冷凍條件下測(cè)定結(jié)果的 RSD為4.58% ～8.15%，表明莫西沙星血漿樣品在室溫放置8 h和－20℃冷凍條件下均有很好的穩(wěn)定性。

2.5 樣品分析

健康受試者(2周內(nèi)未服用任何可能影響本品吸收、代謝的藥物)于早晨空腹以200 mL溫水送服單劑量莫西沙星400 mg，于服藥后1，3，24 h抽取靜脈血5 mL共3份，按擬訂的方法進(jìn)行處理和測(cè)定。結(jié)果3 份樣品的血藥濃度分別為 2.60，1.82，0.48 μg/mL，表明建立的方法可用于實(shí)際藥物濃度的測(cè)定。

3 討論

喹諾酮類藥物是以4－喹諾酮(或稱為吡酮酸)為基本結(jié)構(gòu)的人工合成藥物，在 N1，C3，C6，C7，C8位引入不同基團(tuán)而形成不同藥物，同時(shí)也導(dǎo)致其理化性質(zhì)、抗菌活性有所差異，化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似性也為該類藥物的同時(shí)分離提供了可能[1]。由于結(jié)構(gòu)中含有羧基以及可質(zhì)子化的氮原子，喹諾酮類藥物均具有兩性化合物的特性，色譜行為受流動(dòng)相pH的影響較大。利用液相色譜進(jìn)行分離時(shí)，堿性基團(tuán)會(huì)與固定相未封閉的殘余硅醇基之間發(fā)生相互作用，導(dǎo)致分離時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)生拖尾現(xiàn)象。堿性越強(qiáng)，拖尾現(xiàn)象越嚴(yán)重，如采用Hypersil C18柱分離受試的幾種喹諾酮類藥物時(shí)，莫西沙星保留時(shí)間最長(zhǎng)，拖尾現(xiàn)象最嚴(yán)重，靈敏度無(wú)法滿足測(cè)定要求，調(diào)節(jié)pH、添加掃尾劑也未得到明顯改善。將分析柱調(diào)整為C8柱后，莫西沙星峰形明顯改善、靈敏度增高、保留時(shí)間適中，因此本試驗(yàn)中選用C8柱作為分離柱。

作為酸堿兩性化合物，喹諾酮類藥物在水溶液中可以多種離子形式存在，需對(duì)流動(dòng)相的pH進(jìn)行調(diào)節(jié)。篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，pH為3.0～4.0時(shí)對(duì)大多數(shù)藥物較合適，低pH流動(dòng)相也可抑制硅醇的離解，有利于改善峰形;加入三乙胺可進(jìn)一步改善峰形，對(duì)其使用濃度進(jìn)行篩選后選用1%三乙胺。綜合考慮靈敏度、保留時(shí)間和選擇性，最終選擇以磷酸緩沖鹽、甲醇、乙腈為流動(dòng)相，以三乙胺作為掃尾劑調(diào)節(jié)峰形和靈敏度。在實(shí)際檢測(cè)時(shí)，可以根據(jù)分析的品種對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行微調(diào)，以使分離效果最佳化。由于含有的取代基團(tuán)不一樣，受試的幾種藥物最大吸收波長(zhǎng)并不一致，在進(jìn)行實(shí)際樣品分析時(shí)，可根據(jù)具體分析品種選擇合適的檢測(cè)波長(zhǎng)，以進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。

試驗(yàn)表明，采用常用的幾種蛋白沉淀試劑直接沉淀蛋白時(shí)，干擾物較多，且靈敏度較差。在一定pH條件下，以二氯甲烷提取后可消除大部分內(nèi)源性干擾物質(zhì)。在測(cè)定莫西沙星時(shí)，采用0.5 mol/L的氫氧化鈉10 μL以調(diào)節(jié)萃取液酸堿度，可明顯提高莫西沙星的萃取效率。樣品測(cè)定結(jié)果表明，建立的高效液相色－紫外分光光度法可用于人體血樣濃度的測(cè)定。

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