何鳳娟， 肖衍宇， 操 鋒， 孫敏捷， 平其能

(中國(guó)藥科大學(xué)藥劑學(xué)教研室，江蘇 南京 210009)

左乙拉西坦(levetiracetam，LEV)為一種新型抗癲癇藥物，具有較強(qiáng)的抗癲癇活性，且對(duì)部分性和全身性發(fā)作均有效;本品極易溶于水，口服后可被迅速吸收，生物利用度接近100%，血漿蛋白結(jié)合率小于10%，平均半衰期約為7 h［1］。目前，國(guó)內(nèi)市售LEV制劑僅1種，即每次500～1500 mg，每日需給藥2次的口服片劑，該片劑口服后，因藥物釋放迅速，血藥濃度較高，可引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)，如嗜睡、疲勞、協(xié)調(diào)困難和行為失常等。為了在確保LEV療效的前提下降低其不良反應(yīng)發(fā)生率，比利時(shí)優(yōu)時(shí)比(UCB)制藥公司研制了每日只需給藥1次的LEV緩釋片劑(商品名:Keppra XRTM)，該制劑已于2009年獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，但目前并未在國(guó)內(nèi)上市。筆者所在課題組參考相關(guān)文獻(xiàn)，以羥丙甲基纖維素(HPMC)為骨架材料制備了與 Keppra XRTM具有相似釋藥行為的LEV緩釋片，其制備工藝簡(jiǎn)單、質(zhì)量可控，符合大規(guī)模生產(chǎn)要求。

1 儀器與試藥

LC-10AT型高效液相色譜儀(日本島津公司);RS-8型智能溶出試驗(yàn)儀(天津大學(xué)無(wú)線電廠);TDP型單沖壓片機(jī)(江蘇省泰州市金泰制藥機(jī)械有限公司);YPD-300D型片劑硬度儀(上海黃海藥檢儀器廠);BY300A型小型包衣鍋(上海黃海藥檢儀器廠)。

左乙拉西坦原料藥(批號(hào):091001，純度:99.3%，北京世紀(jì)邁勁生物科技有限公司);左乙拉西坦緩釋片(商品名:Keppra XRTM，批號(hào):57577，規(guī)格:500 mg，比利時(shí)UCB制藥公司);HPMC(型號(hào):Methocel K4M、Methocel K15M 和 Methocel K100M，上?？房蛋录夹g(shù)有限公司);聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30，美國(guó)國(guó)際特品公司)，歐巴代(Opadry，型號(hào):OY-C-7000A，上?？房蛋录夹g(shù)有限公司);甲醇(色譜純，江蘇漢邦科技有限公司);雙蒸水為實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法

2.1 分析方法的建立和考察

2.1.1 色譜條件 固定相為Diamonsil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇－水(0.3 mol·L－1KH2PO4，以 H3PO4調(diào)節(jié) pH 值至3.0)(25∶75)，流速為1 mL·min－1;柱溫為40 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為 210 nm;進(jìn)樣量為 20 μL［2-3］。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取LEV原料藥適量，精密稱定，溶解于pH 6.0的磷酸鹽緩沖液中配制成質(zhì)量體積濃度為100 mg·L－1的貯備液，再以 pH 6.0的磷酸鹽緩沖液稀釋制得質(zhì)量體積濃度分別為8、10、15、20、30、40 和 60 mg·L－1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣，以色譜峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量體積濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=2943.7X+1417.5(r=0.9999)。可見，LEV 在8 ～60 mg·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 分析方法專屬性 取LEV原料藥適量，精密稱定，溶解于流動(dòng)相中配制成濃度為50 mg·L－1的供試溶液。按優(yōu)化后的處方比例稱取HPMC K15M、PVP K30和硬脂酸鎂，過80目篩混勻，取混勻后的輔料25 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加流動(dòng)相適量，超聲波處理30 min，使HPMC充分溶解，然后以流動(dòng)相定容，最后以孔徑為0.45 μm的濾膜濾過，取續(xù)濾液0.5 mL置10 mL量瓶中，以流動(dòng)相定容，即得。取上述制備的LEV供試液和輔料供試液進(jìn)樣，考察在“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件下輔料對(duì)LEV測(cè)定的干擾情況。結(jié)果顯示，輔料對(duì)LEV測(cè)定無(wú)干擾(見圖1)，表明該方法專屬性良好。

圖1 左乙拉西坦原料藥和輔料的HPLC圖譜Figure 1 The HPLC chromatogram of LEV and excipients

2.1.4 精密度 取LEV原料藥10 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加入pH 6.0磷酸鹽緩沖液適量，超聲波處理3 min，以pH 6.0磷酸鹽緩沖液定容，所得溶液過0.45 μm濾膜后，分別移取1、3和6 mL續(xù)濾液至10 mL量瓶中，以pH 6.0磷酸鹽緩沖液定容，配制成3種濃度的LEV供試液，分別在1天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，考察日內(nèi)精密度;每天進(jìn)樣1次，連續(xù)5天，考察日間精密度。結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度RSD分別為0.48%、0.60%和0.46%，日間精密度RSD分別為2.52%、3.12%和2.96%，均小于5%，表明該方法精密度良好。

2.1.5 加樣回收率 按優(yōu)化后的處方比例稱取HPMC K15M、PVP K30和硬脂酸鎂，過80目篩(篩孔徑0.18 mm)混勻，取混勻后的輔料25 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，平行9份，然后按處方量的80%、100%和120%加入LEV原料藥，每個(gè)藥物量平行3份，再加入pH 6.0磷酸鹽緩沖液至刻度，待HPMC充分溶解后過孔徑為0.45 μm的濾膜，取續(xù)濾液1 mL稀釋至10 mL，配制成3種濃度的供試液，進(jìn)樣，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果顯示，上述低、中、高濃度供試液回收率分別為(99.61±0.01)%、(98.61±0.01)%和(99.02±0.01)%，RSD分別為0.98%、0.42%和0.97%，表明該分析方法準(zhǔn)確度較高，符合方法學(xué)要求。

2.2 體外釋放度的測(cè)定

參考市售制劑選擇的釋放條件［4］，采用《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅩC中的轉(zhuǎn)籃法［5］，溶出介質(zhì)為pH 6.0磷酸鹽緩沖液900 mL，溫度為(37 ±0.5)℃，轉(zhuǎn)籃轉(zhuǎn)速為 100 r·min－1，分別于0.5、1、2、4、6、8、10 和 12 h 時(shí)取樣 5 mL，同時(shí)向溶出杯中補(bǔ)充同溫等量溶出介質(zhì)。每次所取樣品經(jīng)濾膜(孔徑0.45 μm)過濾，取續(xù)濾液1 mL置于10 mL量瓶中，定容后進(jìn)樣，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算LEV的累積釋放百分率。

2.3 左乙拉西坦緩釋片制備工藝的優(yōu)化

將LEV原料藥和HPMC過80目篩混勻，加入5%PVP K30乙醇溶液制成軟材，過20目篩(篩孔徑0.83 mm)制粒，60℃下干燥后再以18目篩(篩孔徑0.88 mm)整粒，然后加入適量硬脂酸鎂混合均勻，使用11#(19 mm×7.5 mm)深凹橢圓形沖模進(jìn)行壓制，即得規(guī)格為500 mg的素片。稱取一定量的歐巴代，加入85%的乙醇溶液，使歐巴代質(zhì)量體積濃度為70 g·L－1，室溫?cái)嚢?0 min后采用小型包衣鍋進(jìn)行包衣，包衣溫度40℃，包衣增重為片芯質(zhì)量的3%，包衣結(jié)束后在包衣鍋內(nèi)40℃下固化30 min。按“2.2”項(xiàng)下方法對(duì)在不同 HPMC型號(hào)、LEV與HPMC質(zhì)量比、制備方法和片劑硬度條件下所制片劑的LEV累積釋放百分率進(jìn)行測(cè)定。采用相似因子法對(duì)自制緩釋片與市售緩釋制劑的體外釋藥行為進(jìn)行比較。相似因子(f2)計(jì)算公式如下:

其中，Rt為參比樣品在t時(shí)間的釋放度，Tt為供試品在t時(shí)間的釋放度，n為取樣點(diǎn)數(shù)。

2.4 左乙拉西坦緩釋片在不同pH釋放介質(zhì)中釋放行為的考察

對(duì)優(yōu)化后工藝所得的LEV緩釋片在pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.5醋酸－醋酸鈉緩沖液、pH 6.0磷酸鹽緩沖液與雙蒸水中的釋藥行為進(jìn)行考察。

2.5 左乙拉西坦緩釋片穩(wěn)定性的初步考察

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅪⅩC中的原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則［6］，對(duì)按優(yōu)化后處方自制的一批LEV緩釋片進(jìn)行穩(wěn)定性考察:將自制LEV緩釋片置于潔凈的表面皿中，分別于(90±5)%、(75±5)%濕度，60℃高溫，以及(4500±500)Lx強(qiáng)光照射條件下放置10 d，于第5和10 d取樣，考察片劑的外觀性狀、增重情況、藥物含量及不同時(shí)間點(diǎn)的累積釋放百分率。

3 結(jié)果

3.1 左乙拉西坦緩釋片制備工藝的單因素考察結(jié)果

3.1.1 市售左乙拉西坦緩釋片釋放曲線的繪制體外釋放度測(cè)定結(jié)果顯示，市售LEV緩釋片Keppra XRTM中LEV在0.5、2和8 h時(shí)的累積釋放百分率分別為(19.56±0.07)%、(47.52±0.28)%和(94.34±1.65)%，其釋放曲線如圖2所示。

圖2 Keppra XRTM中LEV在pH 6.0磷酸鹽緩沖液中的釋放曲線Figure 2 The LEV release curve of Keppra XRTMin pH 6.0 phosphate buffer solution

3.1.2 羥丙甲基纖維素型號(hào)的選擇 固定LEV與HPMC的質(zhì)量比為3∶1，分別選用HPMC K 4M、K 15M和K 100M這3種不同黏度的HPMC為骨架材料，按“2.3”項(xiàng)下方法壓片，制得片劑 A、B、C，并對(duì)片劑中LEV在pH 6.0磷酸鹽緩沖液中的累積釋放百分率進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，選用K 4M和K 15M為骨架材料所制備的緩釋片釋藥速率較快，而用黏度較高的K 100M制備的緩釋片釋藥速率最慢(見圖3)。片劑A、B、C 與市售制劑的 f2分別為 68.64、81.08和49.75，表明用K 15M制備的緩釋片釋藥行為與市售制劑最為接近，故在后續(xù)研究中選擇K 15M作為緩釋骨架材料。

圖3 用不同型號(hào)HPMC所制緩釋片的藥物釋放曲線Figure 3 The release curves of LEV sustained-release tablets prepared with different types of HPMC

3.1.3 左乙拉西坦與羥丙甲基纖維素比例的確定 選擇K15M作為骨架材料，對(duì)在不同LEVK15M 質(zhì)量比(2∶1、3∶1和 4∶1)條件下制備的緩釋片A、B、C中LEV體外釋放度及f2進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，隨著K15M比例的增加，LEV釋藥速率逐漸降低(見圖4)。緩釋片 A、B、C與 Keppra XRTM的 f2分別為 66.33、81.07、63.93，其中緩釋片 B的釋藥行為與Keppra XRTM最為接近，故確定LEVK15M質(zhì)量比為3∶1。

圖4 不同LEV-HPMC質(zhì)量比下制備的LEV緩釋片的藥物釋放曲線Figure 4 The release curves of LEV sustained-release tablets prepared under different LEV-HPMC ratios

3.1.4 制備方法的選擇 確定LEV與K15M質(zhì)量比為3∶1，分別以“2.3”項(xiàng)下濕法制粒壓片工藝(工藝1)和粉末直接壓片工藝(工藝2，即稱取與濕法制粒工藝中相同質(zhì)量的HPMC K 15M、PVPK30和硬質(zhì)酸鎂，過80目篩，以等量遞增法混勻，壓片)進(jìn)行壓片，硬度均為17 kg，并對(duì)片劑中LEV在pH 6.0磷酸鹽緩沖液中的累積釋放百分率進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，上述2種制備工藝所得緩釋片的藥物釋放曲線無(wú)顯著性差異(見圖5)。工藝1和工藝2所制得的緩釋片與 Keppra XRTM的 f2分別為70.68和82.44，考慮到國(guó)內(nèi)廠家多以濕法制粒為主，最終選擇濕法制粒工藝。

圖5 不同方法制備的LEV緩釋片的藥物釋放曲線Figure 5 The release curves of LEV sustained-release tablets prepared by different methods

3.1.5 片劑硬度的選擇 將LEV與K15M按質(zhì)量比為3∶1，以濕法制粒法制得的同一批顆粒制成硬度分別為13～15、16～17和18～19 kg的緩釋片 A、B、C，并測(cè)定LEV在pH 6.0磷酸鹽緩沖液中的累積釋放百分率。結(jié)果顯示，片劑硬度范圍為13～19 kg時(shí)，硬度對(duì)片劑LEV釋放行為無(wú)顯著影響(見圖6)。

圖6 不同硬度的LEV緩釋片的藥物釋放曲線Figure 6 The release curves of LEV sustained-release tablets with different hardness

上述3種硬度的LEV緩釋片與Keppra XRTM的f2分別為77.29、76.28和76.67。為防止包衣過程中片劑硬度過小而導(dǎo)致的掉粉和硬度過大造成的壓片機(jī)磨損，本研究確定LEV緩釋片硬度為16～17 kg。

3.2 左乙拉西坦緩釋片在不同pH釋放介質(zhì)中的釋放行為

實(shí)驗(yàn)顯示，釋放介質(zhì)pH值對(duì)LEV的釋放行為無(wú)顯著影響(見圖7)。此外，不同pH下的LEV釋放曲線與Keppra XRTM的f2均在70以上。為方便起見，在后續(xù)穩(wěn)定性研究中選用雙蒸水作為釋放介質(zhì)。

圖7 LEV緩釋片在不同pH釋放介質(zhì)中的釋放曲線Figure 7 The release curves of LEV sustained-release tablets in dissolution medium of different pH values

3.3 左乙拉西坦緩釋片穩(wěn)定性考察結(jié)果

LEV緩釋片穩(wěn)定性研究結(jié)果如表1所示。經(jīng)不同條件處理的緩釋片LEV含量及釋放度等各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯改變;需注意的是緩釋片在(90±5)%的高濕度條件下易吸潮，表面包衣層起皺，提示該制劑在貯藏過程中需注意防潮。

表1 LEV緩釋片穩(wěn)定性研究結(jié)果Table 1 The results of stability study on LEV sustained-release tablets

4 討論

1)LEV具有一定的刺激性氣味且味微苦，故研究中對(duì)緩釋片進(jìn)行包衣，以掩蓋藥物的不良?xì)馕?，提高患者服藥的依從性?/p>

2)由于LEV給藥劑量較大，為確?；颊哂盟幍囊缽男?，片重應(yīng)盡可能小;而若要達(dá)到理想的緩釋效果，緩釋材料又不能太少，因此綜合考慮片重和藥物釋放效果，在HPMC型號(hào)的篩選試驗(yàn)中，暫定LEV與HPMC的質(zhì)量比為3∶1。

3)相似因子法可直接對(duì)釋藥數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，不需對(duì)各種釋藥曲線進(jìn)行擬合，現(xiàn)已被FDA推薦應(yīng)用，故本研究采用該法比較自制緩釋片與市售緩釋片的體外釋藥行為。一般來說，f2越接近于100，表明2種制劑的體外釋藥行為越相近;f2值在50～100間時(shí)，可認(rèn)為2種制劑體外釋藥行為無(wú)顯著差異［7］。

4)水溶性藥物主要通過擴(kuò)散作用從HPMC骨架片中釋放，此外也會(huì)隨著HPMC水凝膠的溶蝕而釋放［8-9］。對(duì)于該自制LEV緩釋片劑，由于LEV屬于高水溶性藥物，釋藥迅速，因此片劑中藥物釋放速度主要取決于所用HPMC的自身性質(zhì)?；诖?，筆者著重對(duì)HPMC的型號(hào)和用量進(jìn)行了考察。研究發(fā)現(xiàn)，選用高黏度的K100M為骨架材料時(shí)，LEV釋放速率明顯低于另外2種型號(hào)的HPMC，原因是HPMC黏度越大，形成的凝膠層強(qiáng)度越大，骨架溶蝕速率越慢;LEV釋放速率隨著HPMC用量的增加而減緩，這是因?yàn)镠PMC用量增加時(shí)，其形成的水化凝膠層的厚度也會(huì)增大，從而影響藥物的釋放［10-11］;本實(shí)驗(yàn)中片劑硬度的增加并不會(huì)減緩LEV的釋放速率，筆者認(rèn)為，該自制緩釋片主要通過HPMC水化凝膠層釋放藥物，影響其釋放速率的關(guān)鍵因素應(yīng)為水化后的凝膠骨架片的曲率和孔隙率［9，12］，而硬度只能影響 HPMC 骨架片本身的密度和骨架未水化時(shí)的曲率和孔隙率，因此實(shí)驗(yàn)中不同硬度的緩釋片其藥物釋放行為無(wú)明顯差異。

5)經(jīng)工藝優(yōu)化，本研究最終確定了LEV緩釋片的最佳制備工藝:以K15M為緩釋骨架材料，LEV與K15M質(zhì)量比為3∶1，通過濕法制粒工藝壓片，片劑硬度為16～17 kg。該制備工藝簡(jiǎn)單易行，穩(wěn)定性好，易于控制，符合大規(guī)模生產(chǎn)要求。

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