王素云 潘 崚 郝洪嶺 王 超 李 燕 楊 潔 王瑞倉 李 杰 袁 軍

(河北省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

癌基因和抑癌基因表達調(diào)控失常均可引起細胞增殖失控導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten)基因及其蛋白表達異常與一些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤細胞的生物學(xué)行為和腫瘤的預(yù)后關(guān)系密切，其在包括多種惡性血液病在內(nèi)的多種惡性腫瘤單個核細胞株和原發(fā)腫瘤中出現(xiàn)高突變率和功能缺失〔1～4〕。多發(fā)性骨髓瘤(MM)目前尚無治愈方法。遺傳學(xué)改變被認(rèn)為是MM發(fā)病的重要致病因素，抑癌基因缺失是重要的遺傳學(xué)變化。目前，在多個骨髓瘤細胞株及骨髓瘤患者中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該基因存在不同程度突變或大片段缺失〔5～7〕，從而導(dǎo)致PTEN基因及蛋白表達缺失，喪失其抑癌基因活性。前期研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染野生型PTEN基因后能明顯抑制骨髓瘤細胞系RPMI8226細胞增殖及凋亡〔8〕。由于RPMI 8226中存在一定程度PTEN mRNA及蛋白表達〔8〕，本研究通過導(dǎo)入PTEN siRNA，封閉PTEN基因及蛋白表達，探討其對骨髓瘤RPMI8226細胞增殖、凋亡及侵襲的研究及其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 引物、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(北京賽百盛);SYBR Green Real Master Mix(北京天根);PTEN、FAK、p－FAK(Tyr397)、MMP－9、MMP－2、Survivin、β－actin 鼠抗人單克隆抗體(Santa Cruz)、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(北京鼎國)，Caspase－Glo 3/7 活性檢測試劑盒，PTEN siRNA、NS－siRNA(上海吉瑪生物工程公司)，Lipofectamine 2000TM(Invitrogen公司)，PTEN siRNA 序列 5′－AAC CCA CCA CAG CUA GAA Ctt－3′;5′－AAG UUC UAG CUG UGG UGG Gtt －3′。對照 siRNA 序列 5′－ UUC UCC GAA CGU GUC ACG Utt －3′;5′－ACG UGA CAC GUU CGG AGA A tt －3′。

1.1.2 細胞系 RPMI8226細胞用含15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞系均為本實驗室長期保存細胞系。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染 將1×105細胞接種到6孔板，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁生長至70%密度時進行轉(zhuǎn)染。按每孔取 50 μmol/L 的 siRNA 儲液 2 μl，溶于 100 μl無血清、無抗生素、無核酶的RPMI1640培養(yǎng)液中，混勻。按每孔Lipofectamine 2000TM5 μl，溶于 100 μl無血清、無抗生素、無核酶的RPMI1640培養(yǎng)液中，混勻，室溫靜置5 min。混合后，室溫靜置20 min。棄去6孔板中的培養(yǎng)液，用無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗滌細胞兩次，每孔換新鮮的上述培養(yǎng)液1.8 ml，再將上述的混合液加入每孔細胞中，混勻后置培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后6 h，更換為含10%FBS的無抗生素、無核酶的 RPMI1640培養(yǎng)液，細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞生長曲線(MTT法) 采用96孔板，取對數(shù)生長期RPMI8226細胞每孔接種5000個，每組3個復(fù)孔，每孔體積100 μl。分為未轉(zhuǎn)染組(對照組)、NS－siRNA 組(轉(zhuǎn)染 NS－siRNA)和 PTEN－siRNA 組(轉(zhuǎn)染 PTEN－siRNA)，轉(zhuǎn)染細胞。于培養(yǎng)后 0、1、2、3、4、5、7 d，不同時間點每孔加入噻唑蘭(MTT)溶液(5 mg/ml)10 μl，37℃孵育4 h后離心棄培養(yǎng)液，另加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl振蕩15 min，酶標(biāo)儀檢測每孔OD 540值。以吸光度值A(chǔ)值為縱坐標(biāo)，時間(d)為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。計算生存率，公式:生存率=轉(zhuǎn)染PTEN－siRNA組A值/轉(zhuǎn)染NS－siRNA組A值×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 細胞周期檢測 收集轉(zhuǎn)染不同時間的細胞，每組收集1×106個，70%乙醇4℃固定過夜;加入RNA酶，室溫30 min后加入碘化丙啶(PI)，4℃存放15 min以上，流式細胞儀檢測，分析凋亡率及各細胞周期比例。

1.2.4 實時熒光定量PCR ①收集不同組RPMI8226細胞，TRIzol提取細胞總RNA，電泳鑒定RNA并定量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。②實時熒光定量PCR反應(yīng):SYBR反應(yīng)體系共25 μl。反應(yīng)條件為 94℃ 5 min，94℃ 45 s，60℃ 1 min，30 個循環(huán)，設(shè)空白對照。PCR反應(yīng)前3～15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，調(diào)節(jié)基線至適宜處，各熒光曲線與基線交叉點的循環(huán)數(shù)即為 Ct值。根據(jù) C(t)=C(t)GENE－C(t)β－actin，C(t)=2－C(t)計算檢測基因mRNA相對表達量，每組重復(fù)3次取平均值。所檢測的基因及相關(guān)PCR引物序列見表1。

表1 FQPCR擴增引物序列

1.2.5 Western印跡檢測PTEN、FAK、p－FAK蛋白表達 收集不同標(biāo)本細胞，每樣本107細胞，加入200 μl預(yù)冷的蛋白裂解液4℃裂解1 h，冰浴下超聲裂解15 min。12000 r/min 4℃離心20 min，取上清用考馬斯亮藍試劑盒測定蛋白濃度，分裝后置－20℃保存。取80 μg樣品蛋白質(zhì)加入等體積上樣緩沖液，經(jīng)5%濃縮膠和10%SDS－PAGE凝膠電泳后，用水浴式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。經(jīng)5%BSA 37℃封閉1 h，分別加入小鼠抗人單克隆抗體，4℃孵育過夜。TBS漂洗5 min×3次，加入山羊抗小鼠HRP標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h，TBS漂洗5 min×3次，化學(xué)發(fā)光法檢測后分析結(jié)果。

1.2.6 Transwell小室細胞侵襲實驗 將50 mg/L的Matrigel 4℃融化，用無血清 RPMI1640培養(yǎng)基將其 1∶8稀釋混勻。200 μl包被Transwell小室聚碳酸脂膜上室面，4℃風(fēng)干。不同轉(zhuǎn)染組細胞加入無血清培養(yǎng)基孵育12 h。取105細胞加入800 μl無血清培養(yǎng)基中，加入0.1%的BSA維持滲透壓，放入Transwell小室上層。下室加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基1000 μl，孵育24 h。取出Transwell小室，用下室培養(yǎng)液反復(fù)淋洗下室底面，用棉簽擦去多聚碳酸鹽膜上層細胞，立刻在倒置熒光顯微鏡下觀察黏附在小室下層有熒光細胞的數(shù)量，400倍顯微鏡下計數(shù)10個視野取平均值。將脫落及淋洗下來的細胞在倒置顯微鏡下計數(shù)有熒光細胞數(shù)量后MTT間接計數(shù)。整個操作過程在冰上及無菌條件下進行并重復(fù)試驗3次。

1.2.7 Caspase－3/7活性檢測 將不同轉(zhuǎn)染組細胞(5000個)/100 μl，加于96孔板中，每組3 個復(fù)孔，將 Caspase－Glo 3/7或9底物和緩沖液混合，取100 μl加入上述標(biāo)本中，混合孵育4 h后酶標(biāo)儀測波長405 nm處的吸光值，空白孔作參照，計算處理組吸光度與對照組吸光度的比值，確定活化程度。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SAS8.0統(tǒng)計軟件，兩樣本均數(shù)比較應(yīng)用t檢驗，多樣本均數(shù)比較應(yīng)用方差分析，率的比較應(yīng)用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PTEN－siRNA轉(zhuǎn)染 RPMI8226細胞的效果 RT－PCR和Western印跡分析結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染無關(guān)序列即對照NS－siRNA的細胞相比，PTEN－siRNA導(dǎo)入可降低PTEN表達80%以上。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示在應(yīng)用PTEN－siRNA轉(zhuǎn)染RPMI 8226細胞48 h時，PTEN mRNA表達水平達到最低。轉(zhuǎn)染后48 h，PTEN mRNA表達水平在 NS－siRNA轉(zhuǎn)染組為 1.107±0.306，PTEN－siRNA轉(zhuǎn)染組為0.143±0.045，二組相比有顯著性差異(P＜0.01)。Western印跡法檢測PTEN蛋白表達水平的結(jié)果顯示:應(yīng)用 PTEN－siRNA轉(zhuǎn)染 RPMI8226細胞48 h時，PTEN蛋白表達水平達到最低。轉(zhuǎn)染后48 h，NS－siRNA轉(zhuǎn)染組PTEN蛋白表達水平為0.699±0.130，PTEN－siRNA轉(zhuǎn)染組為0.089±0.025，二者相比差異顯著(P＜0.01)。

2.2 MTT實驗檢測RPMI8226細胞生長曲線 RPMI8226細胞轉(zhuǎn)染PTEN－siRNA后第1～6天出現(xiàn)差異，4 d以后細胞生長逐漸降低，在第4天細胞生存率最大，為(141.55±8.34)%，NS－siRNA轉(zhuǎn)染組和PTEN－siRNA轉(zhuǎn)染組OD 490值比較有顯著差異(P＜0.01)。

2.3 流式細胞學(xué)檢測細胞周期變化 PTEN－siRNA轉(zhuǎn)染RPMI 8226細胞后，分別于0、24、48、72 h收集各組細胞，流式細胞儀檢測細胞周期變化，并根據(jù)細胞周期圖亞二倍體凋亡峰分析細胞凋亡率。細胞周期分析顯示PTEN－siRNA轉(zhuǎn)染RPMI8226細胞48 h后，G0/G1期細胞比例升高，G2/M期和S期細胞比例降低。凋亡峰顯示細胞凋亡減少。見圖1。

圖1 PTEN-siRNA轉(zhuǎn)染RPMI8226細胞后不同時間細胞周期分布

2.4 PTEN－siRNA對人MM細胞株RPMI8226細胞侵襲的影響 未轉(zhuǎn)染組、NS－siRNA和PTEN－siRNA黏附于下室面的細胞數(shù)量分別為:49.33±7.63、47.17±7.76和 79.50±11.89，NS－siRNA和PTEN－siRNA二組相比差異顯著(P＜0.01)。

2.5 轉(zhuǎn)染 PTEN－siRNA 對 RPMI8226細胞 Survivin、Caspase－3、Caspase－7、FAK、MMP－2 和 MMP－9 mRNA 的影響 轉(zhuǎn)染 PTEN siRNA后隨著PTEN mRNA表達的減低，凋亡相關(guān)基因Survivin mRNA表達水平增加，Caspase－3/－7 mRNA及蛋白活性表達水平減低，F(xiàn)AK mRNA MMP－2/－9 mRNA 表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

2.6 轉(zhuǎn)染 PTEN－siRNA轉(zhuǎn)染對 RPMI8226細胞 FAK、p－FAK、MMP－2 和 MMP－9 蛋白及 Caspase－3/－7 及蛋白活性表達的影響

轉(zhuǎn)染PTEN siRNA后隨著PTEN mRNA表達的減低，凋亡相關(guān)蛋白Survivin表達水平增加，Caspase－3/－7及蛋白活性表達水平減低。FAK、P－FAK、MMP－2/－9 蛋白表達水平升高。見圖 2，表3。

表2 轉(zhuǎn)染48 h后 Survivin、Caspase-3、-7、PTEN、FAK、MMP-2、MMP-9 mRNA 表達情況(± s，n=3)

表2 轉(zhuǎn)染48 h后 Survivin、Caspase-3、-7、PTEN、FAK、MMP-2、MMP-9 mRNA 表達情況(± s，n=3)

與 PTEN－siRNA 組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

e－7 mRNA FAK mRNA MMP－2 mRNA MMP－9 mRNA未轉(zhuǎn)染組 1.049±0.2482) 1.013±0.2072) 1.008±0.1982) 1.015±0.1962) 0.979±0.3081) 1.002±0.2132) 1.086±0.2191)組別 PTEN mRNA survivin mRNA Caspase－3 mRNA Caspas NS－siRNA組 1.107±0.3062) 1.008±0.1912) 0.979±0.1742) 1.003±0.2042) 0.940±0.3012) 0.998±0.2062) 1.029±0.2801)PTEN－siRNA組 0.143±0.045 2.534±0.059 0.473±0.069 0.510±0.033 2.176±0.612 2.793±0.740 1.980±0.733

表3 轉(zhuǎn)染RPMI8226細胞PTEN-siRNA不同時間后Caspase3/7蛋白活性變化( ± s，n=3)

表3 轉(zhuǎn)染RPMI8226細胞PTEN-siRNA不同時間后Caspase3/7蛋白活性變化( ± s，n=3)

與0 h組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與 PTEN－siRNA組比較:3)P ＜0.01，4)P ＜0.05

0 h 24 h 48 h 72 h未轉(zhuǎn)染組 0.314±0.029 0.348±0.0383) 0.357±0.0334) 0.370±0.0344)組別NS－siRNA 組 0.314±0.029 0.347±0.0363) 0.360±0.0344) 0.369±0.0384)PTEN－siRNA組 0.314±0.029 0.230±0.0261) 0.115±0.0182) 0.073±0.0082)

圖2 PTEN、FAK、P-FAK、MMP-2、-9蛋白表達水平差異

3 討論

PTEN表達異常與多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤密切相關(guān)〔2，3〕，幼年型粒單核細胞白血病(JMML)病人常見PTEN缺失〔4〕，提示PTEN在調(diào)節(jié)造血細胞增殖、凋亡、惡性轉(zhuǎn)化中的作用。目前，在多個骨髓瘤細胞株及骨髓瘤患者中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有該基因的突變或大片段缺失。Chang等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)71例原發(fā)性MM患者有4例(5.6%)存在PTEN基因片段缺失，4例患者均為Durie－Salmon分期Ⅲ期。10例原發(fā)性漿細胞白血病患者中2例(20%)、10種人 MM 細胞株(HMCLs)中 OCI－My6和 U266(20%)發(fā)現(xiàn)有PTEN雜合性缺失。PTEN缺失多存在于MM進展期，并且在漿細胞白血病和人骨髓瘤細胞株中發(fā)生率明顯升高，這表明PTEN缺失可能與MM疾病進展有關(guān)。

先前實驗我們以腺病毒作為載體將野生型PTEN基因轉(zhuǎn)染RPMI8226細胞和原代MM細胞，結(jié)果顯示PTEN基因高表達可以抑制RPMI8226細胞以及MM原代細胞增殖，并促進細胞凋亡，使細胞周期阻滯于G2/M期，抑制細胞侵襲活性，使細胞侵襲能力降低。其分子機制可能與PTEN抑制FAK/MMP信號通路，下調(diào) FAK、p－FAK 及 MMP－2，－9 的表達有關(guān)〔8〕。由于在 MM細胞株RPMI8226中，存在一定程度的PTEN mRNA和蛋白表達〔9，10〕，本研究結(jié)果表明抑制PTEN表達能夠促進細胞增殖。RPMI8226細胞存在自發(fā)凋亡的現(xiàn)象，轉(zhuǎn)染PTEN－siRNA后導(dǎo)致PTEN基因及蛋白表達的減低，細胞失去了PTEN的抑制，RPMI 8226細胞凋亡明顯減少，從而導(dǎo)致細胞生存率明顯增高。進一步檢測凋亡相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)，PTEN－siRNA作用于RPMI8226細胞后，細胞 Survivin 表達上調(diào)和 Caspase－3，Caspase－3－7 表達受抑，細胞凋亡減少。細胞侵襲實驗結(jié)果顯示，PTEN－siRNA轉(zhuǎn)染使RPMI8226細胞的侵襲力增加。這與先前研究結(jié)果:PTEN基因轉(zhuǎn)染RPMI8226細胞使之高表達PTEN基因得到的結(jié)論互相一致〔8〕，進一步檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK、p－FAK、MMP－2 和 MMP－9 表達水平明顯升高，從而說明PTEN基因能夠降低MM RPMI8226細胞的侵襲活性，并且通過基因和蛋白表達的變化，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)FAK磷酸化水平，進一步調(diào)節(jié)MMP的表達，從而影響細胞的遷移和侵襲能力，為進一步研究PTEN在骨髓瘤中的分子機制奠定了基礎(chǔ)，同時為PTEN基因治療骨髓瘤提供了理論依據(jù)。

1 Jiang BH，Liu LZ.PI3K/PTEN signaling in angiogenesis and tumorigenesis〔J〕.Adv Cancer Res，2009;102:19－651.

2 Gauffin F，Diffner E，Gustafsson B，et al.Expression of PTEN and SHP1，investigated from tissue microarrays in pediatric acute lymphoblastic，leukemia〔J〕.Pediatr Hematol Oncol，2009;26(1):48－56.

3 Silva A，Yunes JA，Cardoso BA，et al.PTEN posttranslational inactivation and hyperactivation of the PI3K/Akt pathway sustain primary T cell leukemia viability〔J〕.J Clin Invest，2008;118(11):3762－74.

4 Liu YL，Castleberry RP，Emanuel PD.PTEN deficiency is a common de－fect in juvenile myelomonocytic leukemia〔J〕.Leuk Res，2009;33(5):671－7.

5 Sakai A，Thieblemont C，Wellmann A，et al.PTEN gene alterations in lymphoid neoplasms〔J〕.Blood，1998;92(9):3410－5.

6 Hyun T，Yam A，Pece S，et al.Loss of PTEN expression leading to high AKT activation in human multiple myelomas〔J〕.Blood，2000;96(10):3560－8.

7 Chang H，Qi XY，Claudio J，et al.Analysis of PTEN deletions and mutations in multiple myeloma〔J〕.Leukemia Res，2006;30(3):262－5.

8 Wang S，Cheng Z，Yang X，et al.Effect of wild type PTEN gene on proliferation and invasion of multiple myeloma〔J〕.Int J Hematology Int J Hematol，2010;92(1):83－94.

9 Pene F，Claessens YE，Muller O，et al.Role of the phosphatidylinositol 3－kinase/Akt and mTOR/P70S6－kinase pathways in the proliferation and apoptosis in multiple myeloma〔J〕.Oncogene，2002;21(43):6587－97.

10 Shi Y，Gera J，Hu L，et al.Enhanced sensitivity of multiple myeloma cells containing PTEN mutations to CCI－779〔J〕.Cancer Res，2002;62:5027－34.