李素清 劉 平 高 楊 劉金霞 馬小彬 (承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院,河北 承德 067000)
干擾素-α(IFN-α)聯(lián)合病毒唑是目前常用的也是較為有效的治療慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC)的方法。然而,其骨髓抑制、抑郁、甲狀腺功能異常等嚴重不良反應,常影響患者的依從性和治療效果,尤其在老年女性患者,甲狀腺功能減退發(fā)生率明顯高于男性和青年患者〔1〕,甚至發(fā)生老年抑郁。本研究通過檢測CHC患者應用IFN-α過程中血清甲狀腺激素水平和外周血單核細胞內(nèi)Th1細胞因子〔IFN-γ、腫瘤壞死因子(TNF-α)〕及 Th2 細胞因子〔白細胞介素-4(IL-4)、IL-10〕mRNA的表達水平,以探討TFN-α對Th1/Th2細胞因子表達的影響并分析這一影響與甲狀腺功能低下的關(guān)系,為CHC患者順利完成抗病毒治療提供理論依據(jù)。
1.1 一般資料 54例CHC患者(CHC組),于2006~2008年在我科門診或住院病房行IFN治療,其中男30例,女24例;年齡18~65〔平均(35.6±17.9)〕歲。既往無精神疾病及其他身心疾病等遺傳疾病史。治療前進行血、尿常規(guī)、肝功能、丙肝病毒(HCV)抗體、HCV、甲狀腺功能、腎功能、血糖、自身免疫相關(guān)項目等詳細檢查,嚴格按照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準《丙型病毒性肝炎診斷標準及處理原則》選擇研究對象,排除其他類型肝炎病毒和免疫缺陷病毒(HIV)病毒感染〔1〕。另外選擇同期體檢的正常人血清20人份,作為正常對照組。
1.2 方法
1.2.1 治療方法 應用聚乙二醇干擾素(PEG-IFNα-2a)180 μg,每周一次,皮下注射,治療過程中嚴密監(jiān)測患者用藥后不良反應,出現(xiàn)自身免疫、骨髓抑制等嚴重不良反應者需被迫停藥者,排除在統(tǒng)計分析范圍內(nèi)。所有病例在應用IFN外均應用相似的保肝降酶治療藥物,在治療觀察期間沒有服用其它對甲狀腺水平有影響藥物,飲食等。用藥時間48 w。
1.2.2 甲狀腺素水平的檢測 分別在治療前、治療12 w和治療終點(療程結(jié)束時),空腹抽取患者靜脈血10 ml,分離血清和外周血單核細胞,化學發(fā)光法檢測血清三碘甲狀腺氨酸(triiodothyronine,T3)、游離三碘甲狀腺氨酸(free triiodothyronine,F(xiàn)T3)、甲狀腺素(thyroxin,T4)、游離甲狀腺素(free thyroxin,T4)、促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone,TSH)、甲狀腺球蛋白(thyroglobulin,TG)試劑盒由美國雅培公司提供,并按說明書要求進行操作。
1.2.3 Th1/Th2細胞因子檢測 分離外周血單核細胞,細胞總RNA抽提藥盒TRIzol(GIBCO公司)抽提細胞總RNA。按SuperscriptⅡ藥盒(GIBCO公司)說明書,將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。β-肌動蛋白(β-actin)、IFN-γ、TNF-α、IL-10 引物由上海生工合成,引物序列見表1。用所得cDNA進行RT-PCR反應,擴增內(nèi)參照 β-actin 及 IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10,PCR 反應條件和引物序列見表1〔2〕。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠(含終濃度0.5 μg/ml溴乙錠)上電泳,Gel-PRO ANALYZER凝膠定量分析軟件進行灰度分析,得到β-actin及4種細胞因子灰度值,將4種細胞因子灰度值分別除以β-actin灰度值,從而得到4種細胞因子相對含量(%)。
1.3 統(tǒng)計學方法 應用SAS8.0統(tǒng)計軟件進行分析,數(shù)據(jù)資料以±s表示,采用t檢驗和方差分析。
2.1 PEG-IFN-α2a治療前后甲狀腺激素水平 應用PEG-IFN-α2a治療前和治療12 w時,檢測血清中甲狀腺激素水平,TSH升高,T3、T4、FT3和FT4降低,其甲狀腺素水平顯著低于正常水平(P<0.05);與正常對照組比較,治療前無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。
2.2 CHC患者治療前與正常對照組Th1/Th2各細胞因子表達水平的比較 CHC患者與正常對照組比較,Th1細胞因子表達水平較低,有統(tǒng)計學差異(P<0.05);而Th2細胞因子表達水平偏高,無統(tǒng)計學差異(P>0.05);感染HCV后出現(xiàn)Th2細胞因子分泌傾向,形成CHC而不能夠自愈。見表3。
表1 Th1/Th2型細胞因子PCR引物序列擴增片段大小及擴增條件
表2 PEG-IFN-α2a治療前、后甲狀腺激素水平比較(s)
表2 PEG-IFN-α2a治療前、后甲狀腺激素水平比較(s)
與治療后比較:1)P<0.05
組別 n TSH(mIU/L) T3(ng/ml) T4(ng/ml) FT3(pmol/L) FT4(pmol/L)正常對照組 20 3.15±0.87 3.79±0.29 115.27±21.41 6.52±1.69 18.42±4.10 CHC組治療前 54 3.48±3.681) 3.32±1.591) 116.58±37.981) 5.18±1.791) 16.97±3.381)CHC組治療后 54 9.28±3.83 2.24±1.66 104.13±37.25 3.87±1.13 13.76±3.64
2.3 CHC患者治療前后各組Th1/Th2細胞因子表達水平的變化 IFN-α聯(lián)合病毒唑治療12 w時Th1/Th2細胞因子表達水平進行分析,發(fā)現(xiàn)治療后Th1類細胞因子IFN-γ和TNF-α的表達水平顯著增高,Th2類細胞因子IL-4和IL-10的表達水平與治療前相比無顯著性變化。見表4。
表3 CHC患者治療前與正常對照Th1/Th2細胞因子表達水平 ± s,%)
表3 CHC患者治療前與正常對照Th1/Th2細胞因子表達水平 ± s,%)
組別 n IFN-γ TNF-αIL-4 IL-10正常對照組 20 27.29±5.26 24.13±3.55 10.07±3.33 15.97±3.21 CHC治療組 54 24.34±3.12 20.32±3.48 12.69±3.22 17.62±2.52 t值 2.963 3.068 1.094 1.897 P值0.004 0.003 0.061 0.612
表4 CHC患者治療前和治療12 w時Th1/Th2細胞因子表達水平的變化(±s,%,n=54)
表4 CHC患者治療前和治療12 w時Th1/Th2細胞因子表達水平的變化(±s,%,n=54)
組別 IFN-γ TNF-αIL-4 IL-10治療前 24.34±3.12 20.32±3.48 12.69±3.221)17.62±2.52治療后 27.38±4.62 24.38±5.26 13.95±4.30 16.36±5.24 t值 4.007 4.730 1.723 1.292 P值 <0.01 <0.01 >0.05 >0.05
Th1和Th2細胞因子誘導的免疫反應相互抑制、相互調(diào)節(jié),處于動態(tài)平衡狀態(tài),維持正常的細胞免疫和體液免疫功能。Th1細胞主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等細胞因子,參與細胞免疫反應;Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細胞因子,參與體液免疫反應??共《局委熑缒芗て饛姷腡h1和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應,則病毒被清除,而弱的Th1反應常伴隨著病毒的持續(xù)感染和治療失敗〔3〕。IFN-α,作為一種炎癥因子,聯(lián)合病毒唑治療CHC的機制之一是由于IFN-α能夠促進Th1細胞因子的分泌〔4〕。在本研究中,從基因表達水平檢測CHC患者在應用INF治療前后Th1/Th2細胞因子mRNA表達水平,并觀察其與甲狀腺激素水平的關(guān)系,探討INF誘導患者甲狀腺功能低下免疫學機制,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在抗病毒治療前,CHC患者IFN-γ、TNF-α的表達均明顯低于正常對照組。提示CHC患者的細胞免疫功能下降,對病毒清除能力減弱,這可能是造成HCV持續(xù)感染的原因之一。對IFN-α聯(lián)合病毒唑治療12 w時Th1類細胞因子IFN-γ和TNF-α的表達水平顯著增高。提示抗病毒治療充分激活了Th1型免疫反應,患者的細胞免疫功能得到恢復,并因此獲得了良好的治療效果。進一步研究發(fā)現(xiàn),INF治療后患者甲狀腺激素水平下降,可能也與由Th1型細胞因子產(chǎn)生增多,上調(diào)甲狀腺濾泡細胞主要組織相容抗原大分子的表達,介導細胞免疫,促進甲狀腺內(nèi)淋巴細胞浸潤,并使浸潤的淋巴細胞和巨噬細胞激活并釋放IFN-α、IL-1、IL-6等細胞因子及產(chǎn)生氧自由基,甲狀腺本身出現(xiàn)自身免疫性炎癥,分泌和合成甲狀腺激素功能減退〔5〕。IL-4主要產(chǎn)生于Th2細胞,可促進IgG、IgA和IgE等抗體的產(chǎn)生,介導體液免疫,在INF治療過程中無明顯變化,因此,Th1和Th2平衡在自身免疫性甲狀腺疾病中被打破,其分泌的細胞因子在表達的量上能夠反映機體總的免疫傾向。
1 彭文偉.傳染病學〔M〕.第5版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:15-45.
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4 Fujimoto T,Tomimatsu M,Iga D,et al.Changes in the Th1/Th2 ratio during a 24-week course of an interferon alpha-2b plus ribavirin combination therapy for patients with chronic hepatitis C〔J〕.J Gastroenterol Hepatol,2008;23(8-2):432-7.
5 Miller AH,Norman Cousins Lecture.Mechanisms of cytokine-induced behavioral changes:psychoneuroimmunology at the translational interface〔J〕.Brain Behav Immun,2009;23(2):149-58.