張 泳， 劉學(xué)紅

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院1醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，2組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，浙江 紹興 312000)

胚胎時(shí)期，食管肌層的分化、生長(zhǎng)發(fā)育受到各種基因的調(diào)控，蛋白是基因的表達(dá)產(chǎn)物，相應(yīng)蛋白在組織細(xì)胞的表達(dá)分布規(guī)律能反映基因的活動(dòng)規(guī)律。巢蛋白(nestin)和微管相關(guān)蛋白2(microtubule－associated protein 2，MAP－2)均屬于細(xì)胞骨架蛋白，其表達(dá)分布規(guī)律反映細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)發(fā)育及增殖能力。目前微管相關(guān)蛋白和巢蛋白在動(dòng)物和人中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中的分布及病理作用機(jī)制研究較多［1－5］，但關(guān)于它們?cè)谌伺咛ナ彻芗影l(fā)育過(guò)程中的表達(dá)、分布規(guī)律及作用機(jī)制，目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文通過(guò)研究人胚胎食管肌層生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中微管相關(guān)蛋白和巢蛋白表達(dá)、分布規(guī)律，探討兩者在食管肌層分化、發(fā)育過(guò)程中的作用，為先天性食管畸形研究提供形態(tài)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

材料和方法

1 胚胎收集與分組

收集發(fā)育正常但因意外原因造成人工流產(chǎn)的人胚胎標(biāo)本16例(每例標(biāo)本均取得產(chǎn)婦本人同意)。根據(jù)產(chǎn)婦末次月經(jīng)、B超所測(cè)胎兒雙頂徑和人胚胎形態(tài)學(xué)特征等確定胎齡為7－16周。以每4周為1月齡組，每月齡為一研究組，其例數(shù)分布如下:第2月齡組5例，第3月齡組6例，第4月齡5例。

2 取材和免疫組織化學(xué)染色程序

從胎尸內(nèi)取出食管標(biāo)本，分別從每例標(biāo)本中切取食管長(zhǎng)約0.4 cm，用4℃生理鹽水沖洗管腔，放入10%中性甲醛水溶液中固定8－12 h后取出，流水沖洗30 min，行常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋。石蠟切片，片厚4 μm，每個(gè)標(biāo)本取4片，行免疫組織化學(xué)染色(所用試劑MAP－2和nestinⅠ抗(小鼠抗人)及其輔助試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。免疫組化染色采用PV法:即切片常規(guī)脫蠟至水→微波抗原修復(fù)→3%H2O2滅活內(nèi)源性酶→滴加Ⅰ抗(抗體濃度為1∶150)→PV6002→DAB顯色(在以上各步之間均用PBS洗滌5分鐘×3次)→蘇木精輕度復(fù)染，然后脫水，透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察。

3 對(duì)照實(shí)驗(yàn)

用PBS替代Ⅰ抗、Ⅱ抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。

結(jié) 果

切片經(jīng)染色后，MAP－2和nestin陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)/膜呈淡黃色、黃色或深黃色，細(xì)胞核不著色。第2月胚齡時(shí)，人胚食管肌層薄，內(nèi)環(huán)肌層僅有2－4層肌細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞排列松散，肌間神經(jīng)叢明顯，內(nèi)有許多細(xì)胞體呈圓形或橢圓形的神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞核大而圓，細(xì)胞質(zhì)少。第3月胎齡時(shí)，食管肌層明顯增厚，內(nèi)環(huán)肌層細(xì)胞層數(shù)增多達(dá)5－8層，細(xì)胞間排列仍較松散。肌間神經(jīng)叢增大，神經(jīng)叢內(nèi)細(xì)胞增多。第4月胎齡時(shí)，食管肌層增厚不明顯，但肌細(xì)胞間排列較致密，肌間神經(jīng)叢與第3月相似。

1 Nestin在第2－4月胎齡人胚胎食管肌層的表達(dá)

第2月齡段，nestin蛋白在肌層肌細(xì)胞處呈廣泛陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖1A、B;第3月齡段，nestin蛋白在肌層肌細(xì)胞處呈廣泛強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖1C;第4月齡段，nestin蛋白在肌層陽(yáng)性表達(dá)明顯減弱，大部分肌細(xì)胞呈陰性表達(dá)，見(jiàn)圖1D。第2－4月，nestin蛋白在肌間神經(jīng)叢內(nèi)部分神經(jīng)細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，隨著胎齡的增大，陽(yáng)性表達(dá)無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖1A－D。

Figure 1.At the second to fourth month of gestation，nestin positive expression(↑)in esophageal muscular layer of human embryos(A:×100;B，C，D:×400).A，B:the second month;C:the third month;D:the fourth month.圖1 在第2－4月胎齡人胚胎食管肌層nestin的陽(yáng)性表達(dá)情況

2 MAP－2在第2－4月胎齡人胚胎食管肌層的表達(dá)

第2－4月齡段，MAP－2在人胚胎食管肌層肌細(xì)胞處均呈陰性表達(dá)，而在肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)纖維處呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度隨胎齡增大而增強(qiáng)，見(jiàn)圖2 A－D。

Figure 2.At the second to fourth month of gestation，MAP－2 postive expression(↑)in esophageal muscular layer of human embryos(A，C，D:×400，B:×40).A:the second month;B，C:the third month;D:the fourth month.圖2 在第2－4月胎齡人胚胎食管肌層MAP－2的陽(yáng)性表達(dá)情況

討 論

巢蛋白為第Ⅵ類(lèi)中間絲蛋白，和細(xì)胞骨架、細(xì)胞信號(hào)、器官發(fā)生、細(xì)胞新陳代謝有關(guān)，并且代表干細(xì)胞增殖、遷移 、分化的特性。它還參與定位和運(yùn)行亞細(xì)胞器，并用來(lái)調(diào)節(jié)骨架蛋白等功能多樣的細(xì)胞增殖、生存和分化［6］。現(xiàn)有研究表明［7－10］，巢蛋白廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物和人的神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、肌組織等多組織、器官。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第2－3月胎齡段的人胚胎食管肌層細(xì)胞內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)，第4月齡大部分肌細(xì)胞呈陰性表達(dá)。說(shuō)明在胚胎發(fā)育的早期階段，食管肌層肌細(xì)胞在第4月齡前尚處于生長(zhǎng)發(fā)育的不成熟期，在大部分肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量合成細(xì)胞骨架成分，促進(jìn)肌細(xì)胞的快速增殖、生長(zhǎng)發(fā)育，向肌細(xì)胞成熟方向發(fā)展，以適應(yīng)胚胎食管隨胎齡增大而增厚的需要。到了第4月齡，食管肌層大部分肌細(xì)胞發(fā)育接近成熟，細(xì)胞骨架成分基本發(fā)育完善，肌細(xì)胞也由活躍的增殖期逐漸轉(zhuǎn)為靜止期，細(xì)胞增殖能力下降，nestin表達(dá)減弱或消失。這與巢蛋白的生物學(xué)特性有關(guān)，即巢蛋白在干細(xì)胞中的表達(dá)通常為一過(guò)性，當(dāng)組織分化成熟時(shí)，巢蛋白的表達(dá)即消失。我們的研究結(jié)果與Su等［10］報(bào)道nestin在大鼠食管肌層的表達(dá)基本一致。更有趣的是我們觀察到nestin在第2－4月齡食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)部分神經(jīng)細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，隨著胎齡的增大，陽(yáng)性表達(dá)無(wú)明顯變化。結(jié)果提示第2－4月齡食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)均存在部分神經(jīng)前體細(xì)胞，這些細(xì)胞在隨胎齡的變化而不斷增殖分化，以彌補(bǔ)在發(fā)育過(guò)程中凋亡的神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。這與Park等［11］報(bào)道敲除nestin的小鼠胚胎神經(jīng)管神經(jīng)上皮細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，再生能力明顯下降相一致。結(jié)合我們前期研究結(jié)果，早期食管發(fā)育階段，食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)存在一定數(shù)量神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，說(shuō)明在早期胚胎食管發(fā)育階段，nestin與食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞的生存和再生相關(guān)。

MAP－2是一種高度保守的蛋白，是微管組裝的啟動(dòng)子，作為細(xì)胞骨架系統(tǒng)重要成分之一，大量地存在于神經(jīng)元的胞體和樹(shù)突中，其能促進(jìn)微管形成、誘導(dǎo)微管成束、防止微管解聚，在神經(jīng)元的生長(zhǎng)和發(fā)育、突起的形成和生長(zhǎng)、軸突和樹(shù)突的細(xì)胞器運(yùn)輸及傳遞信號(hào)等方面起到重要作用，是神經(jīng)元特異性標(biāo)記物之一。錢(qián)軍等［12］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)MAP2的高表達(dá)可能在脊髓損傷后突觸結(jié)構(gòu)的重建及受損神經(jīng)功能代償和修復(fù)中發(fā)揮重要作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第2－4月齡段，MAP－2在人胚胎食管肌層肌細(xì)胞處均呈陰性表達(dá)，而在肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)纖維處呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度隨胎齡增大而增強(qiáng)。結(jié)果提示在第2月齡人胚胎食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞大部分已分化發(fā)育成神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，但它們尚處于發(fā)育早期階段，細(xì)胞比較幼稚，各種細(xì)胞器尚未發(fā)育成熟，細(xì)胞骨架蛋白合成能力有限。隨著胎齡的增大，肌層細(xì)胞層數(shù)增多，肌層增厚，肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞器發(fā)育逐漸完善，細(xì)胞合成微管蛋白能力增強(qiáng)，細(xì)胞增殖活躍，為適應(yīng)食管肌層生長(zhǎng)發(fā)育需要，食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)細(xì)胞釋放較多的信號(hào)，調(diào)控遠(yuǎn)離的肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育。

因此，我們認(rèn)為在人胚胎早期生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，MAP－2和nestin可能參與了調(diào)控食管肌層肌細(xì)胞和神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的分化、發(fā)育。

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