范建輝， 崔金暉， 滕奔琦， 陳新娟， 侯紅瑛

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院產(chǎn)科，廣東 廣州 510630)

胎膜早破(premature rupture of membranes，PROM)是指在臨產(chǎn)前胎膜發(fā)生破裂，是影響母兒健康安全常見的并發(fā)癥之一，包括足月胎膜早破(term premature rupture of membranes，tPROM)和早產(chǎn)胎膜早 破(preterm prematureruptureofmembranes，pPROM)。國(guó)內(nèi)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)［1］，PROM 占足月妊娠的10%，占早產(chǎn)的2% －3.5%，30% －40%的早產(chǎn)和pPROM有關(guān)［2］。發(fā)生胎膜破裂后由于其屏障作用消失，使得圍生期母兒的發(fā)病率、死亡率升高。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)PROM的病因及發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了長(zhǎng)期大量的研究，但其確切的病因及發(fā)病機(jī)制至今仍未明確，本研究通過檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶－9(matrix metallproteinase－9，MMP－9)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在胎膜組織中的表達(dá)，探討PROM發(fā)生的相關(guān)機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 研究對(duì)象 選取2010年4月－2011年1月我院行規(guī)律產(chǎn)檢并臨產(chǎn)前行剖宮產(chǎn)終止妊娠者共60例，均無復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，無吸煙、酗酒、吸毒等不良生活習(xí)慣，排除妊娠合并內(nèi)外科疾病、妊娠期并發(fā)癥，其中pPROM組、tPROM組、正常足月妊娠組(對(duì)照組)各20例，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，3組孕婦的年齡、孕產(chǎn)次無顯著差異。

1.2 器材及試劑 恒溫機(jī)(Thermo)，離心機(jī)(Thermo)，酶標(biāo)儀(Thermo)，微量加液器(Eppendorf)，iNOS兔抗人多克隆抗體(ab3523，Abcam)，MMP－9兔抗人多克隆抗體(ab76003，Abcam)。二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒，內(nèi)含試劑:ChemMateTMEnVisionTM/HRP(兔/小鼠)、DAB緩沖稀釋液和DAB原液(GK500705/10，上?；蚩萍脊?。人MMP－9酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(Uscnlife)。

2 方法

2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)早孕B超及停經(jīng)時(shí)間準(zhǔn)確核對(duì)孕周，PROM診斷標(biāo)準(zhǔn)參考全國(guó)高等學(xué)校教材《婦產(chǎn)科學(xué)》第7 版［1］標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 標(biāo)本收集 所有病例均于剖宮產(chǎn)術(shù)前常規(guī)留取靜脈血3 mL，術(shù)中切開子宮肌層、暴露胎膜后用注射器抽取羊水3 mL。標(biāo)本放于－4℃冰箱中過夜后離心20 min，取上清液放于－20℃冰箱保存待測(cè)。胎盤娩出后立即在無菌條件下取胎膜破口處胎膜組織5－10 g，無菌生理鹽水沖洗去除血跡及羊水，置于10%甲醛固定24－48 h后行常規(guī)石蠟包埋，切片、烤片，其中每個(gè)標(biāo)本切片4張(5 μm)，分別進(jìn)行HE染色和iNOS、MMP－9免疫組化染色，另一張備用或者用作陰性對(duì)照。

2.3 結(jié)果判斷

①HE染色 顯微鏡觀察中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，每高倍鏡視野5－10個(gè)為輕度，11－30個(gè)為中度，＞30個(gè)為重度，中－重度中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)者判斷為絨毛膜羊膜炎［3］。

②免疫組織化學(xué)染色 MMP－9和iNOS均表達(dá)在細(xì)胞漿中，以細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，與背景顏色一致或無明顯著色為陰性，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(×400)，參照 Barnes等［4］進(jìn)行綜合評(píng)分，見表1。

表1 MMP－9和iNOS在胎膜組織中表達(dá)的評(píng)分Table 1.The scoring of MMP－9 and iNOS expression in fetal membranes

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 MMP－9在胎膜組織中的表達(dá)

MMP－9在 tPROM 組(圖 1B)、pPROM 組(圖1C)孕婦胎膜中的表達(dá)水平均高于對(duì)照組(圖1A)，差異顯著(均P＜0.01)。MMP－9在tPROM組孕婦胎膜中的表達(dá)與pPROM組比較，無顯著差異(P＞0.05)，見表 2。

Figure 1.The immunohistochemical staining of MMP－9(×400).A:normal group;B:tPROM group;C:pPROM group.圖1 MMP－9的免疫組化染色

表2 MMP－9在胎膜組織中的表達(dá)Table 2.The expression of MMP－9 in fetal membranes of the three groups(n=20)

2 孕婦血清、羊水中MMP－9水平比較

MMP－9在3組孕婦不同組間母血及羊水的表達(dá)水平比較，pPROM組＞tPROM組＞對(duì)照組，差異顯著(P ＜0.01)，見表3。

表3 MMP－9在血清及羊水中的表達(dá)Table 3.The level of MMP－9 in serum and amniotic fluid in the three groups(ng/L..n=20)

表3 MMP－9在血清及羊水中的表達(dá)Table 3.The level of MMP－9 in serum and amniotic fluid in the three groups(ng/L..n=20)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs tPROM.

Group Serum Amniotic fluid Control 89.74 ±22.85 51.48 ±22.59 tPROM 371.10 ±134.83＊＊ 100.04 ±26.50＊＊pPROM 208.76 ±103.82＊＊## 71.36 ±20.49＊＊##

3 iNOS在胎膜組織中的表達(dá)

iNOS在炎癥細(xì)胞中高表達(dá)，在pPROM組(圖2C)孕婦胎膜中的表達(dá)水平高于對(duì)照組(圖2A)，差異顯著(P＜0.01);iNOS在 tPROM 組(圖2B)孕婦胎膜中的表達(dá)與對(duì)照組比較，無顯著差異(P＞0.05)，與pPROM組比較，無顯著差異(P＞0.05)，見表4。

Figure 2.The immunohistochemical staining picture of iNOS(×400).A:normal group;B:tPROM group;C:pPROM group.圖2 iNOS的免疫組化染色圖片

表4 iNOS在胎膜組織中的表達(dá)Table 4.The expression of iNOS in fetal membranes of the three groups(n=20)

4 MMP－9、iNOS與絨毛膜羊膜炎的關(guān)系

60例孕婦的胎膜組織全部進(jìn)行HE染色，其中絨毛膜羊膜炎(圖3B、C)18例，非絨毛膜羊膜炎(圖3A)42例。MMP－9在絨毛膜羊膜炎胎膜中的表達(dá)水平高于非絨毛膜羊膜炎者，差異顯著(P＜0.05)，iNOS在絨毛膜羊膜炎胎膜中的表達(dá)水平高于非絨毛膜羊膜炎者，差異顯著(P ＜0.01)，見表5、6。

Figure 3.The hematoxylin and eosin(HE)staining of fetal membranes(×200).A:normal fetal membranes;B:mild chorioamnionitis;C:severe chorioamnionitis.圖3 胎膜組織的HE染色

表5 絨毛膜羊膜炎與MMP－9表達(dá)的相關(guān)性Table 5.The relationship between chorioamnionitis and MMP－9 expression

表6 絨毛膜羊膜炎與iNOS表達(dá)的相關(guān)性Table 6.The relationship between chorioamnionitis and iNOS expression

5 對(duì)孕婦胎膜中MMP－9和iNOS的表達(dá)做相關(guān)分析

相關(guān)分析表明MMP－9與iNOS在胎膜中的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.476，P ＜0.01)，見表7。

表7 MMP－9和iNOS表達(dá)的相關(guān)性Table 7.The relationship between MMP－9 and iNOS expression

討 論

孕期胎膜可以使羊膜腔保持無菌狀態(tài)，為胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育提供一個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。隨著孕周的增大，胎膜發(fā)生相應(yīng)變化使其適應(yīng)逐漸增長(zhǎng)的子宮壓力及宮腔容量。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者們主要從感染、營(yíng)養(yǎng)、經(jīng)濟(jì)狀態(tài)、社會(huì)因素等宏觀方面以及細(xì)胞凋亡、炎性細(xì)胞因子、胎膜酶、氧化應(yīng)激、基因多態(tài)性等微觀方面對(duì)PROM的病因及發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，表明這幾個(gè)因素在PROM的發(fā)病機(jī)制中均起到一定作用，而且它們之間也存在著相互作用，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為PROM的發(fā)病應(yīng)該是多因素、多途徑共同相互作用的結(jié)果。

1 MMP－9與PROM

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一種降解和破壞細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，其中MMP－9屬于明膠酶B類，是PROM中研究最多的一種基質(zhì)金屬蛋白酶，Mclaren等［5］證實(shí)分娩發(fā)動(dòng)前宮頸處胎膜中MMPs尤其是MMP－9的活性顯著升高，認(rèn)為MMP－9參與胎膜中膠原的程序性溶解重建過程，Maymon等［6］發(fā)現(xiàn)分娩發(fā)動(dòng)后羊水和胎膜中MMP－9活性明顯升高，PROM患者M(jìn)MP－9在宮頸處胎膜中的濃度比其它地方高，且胎膜中Ⅳ型膠原含量下降明顯，與MMP－9的上升具有相關(guān)性，提示了MMP－9可能是胎膜破裂發(fā)生的重要生理基礎(chǔ)。當(dāng)MMP－9表達(dá)過度時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)降解加快，導(dǎo)致胎膜強(qiáng)度、韌性下降，胎膜結(jié)構(gòu)弱化，可造成PROM的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示MMP－9在3組胎膜中均有一定程度的表達(dá)，尤其在羊膜上皮細(xì)胞中呈高表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7］。同時(shí)顯示tPROM組、pPROM組孕婦血清、羊水及胎膜組織中MMP－9的表達(dá)水平均高于對(duì)照組(P＜0.01)，證實(shí)了MMP－9的正常表達(dá)在孕期維持胎膜完整性方面起著重要作用。

2 iNOS與PROM

一氧化氮(nitric oxide，NO)是20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)的一種多功能因子，除了參與許多生理功能外，NO還與眾多疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。NO結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，性質(zhì)極不穩(wěn)定，容易擴(kuò)散，其生物半衰期只有5 s左右，故對(duì)NO的認(rèn)識(shí)大都集中在對(duì)NOS的測(cè)定。國(guó)外學(xué)者［8］利用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)分析表明，妊娠期NO變化主要由iNOS引起。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示iNOS在pPROM組孕婦胎膜中的表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異顯著(P＜0.01)，故可以推斷 iNOS在pPROM發(fā)病中起到重要作用，此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示iNOS在tPROM組孕婦胎膜中的表達(dá)與對(duì)照組比較，差異無顯著(P＞0.05)，提示tPROM與pPROM可能存在不同發(fā)病機(jī)制，而iNOS在pPROM組孕婦胎膜中的表達(dá)與tPROM組比較，差異無顯著(P＞0.05)，iNOS可能并不參與足月胎膜早破的發(fā)病，但是也可能與本實(shí)驗(yàn)研究例數(shù)較少有關(guān)。

3 MMP－9、iNOS與絨毛膜羊膜炎

目前，大量的臨床醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)、組織學(xué)、微生物學(xué)和分子生物學(xué)資料提示感染與炎癥在PROM的發(fā)生中占主要原因［9］，且互為因果，當(dāng)胎膜破裂后細(xì)菌通過上行性感染傳播到胎膜，誘導(dǎo)或者加重絨毛膜羊膜炎的發(fā)生。有國(guó)內(nèi)學(xué)者統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，pPROM患者中一半與絨毛膜羊膜炎相關(guān)［10］。正常情況下MMP－9在體內(nèi)的合成、分泌、降解均受到嚴(yán)格調(diào)控，研究顯示細(xì)胞因子如IL－6、8、TNF－α及脂多糖［11］等分泌增加可激活MMP－9合成的轉(zhuǎn)錄因子如細(xì)胞核因子 NF－κB，引起 MMP－9的合成增加，同時(shí)MMP－9也可以激活I(lǐng)L－8等，使炎癥反應(yīng)加劇，二者形成正反饋調(diào)節(jié)［12］。本實(shí)驗(yàn)中有絨毛膜羊膜炎孕婦18例，MMP－9在絨毛膜羊膜炎組孕婦胎膜中的表達(dá)水平高于非絨毛膜羊膜炎組，差異顯著(P＜0.05)，說明MMP－9表達(dá)和體內(nèi)的炎癥反應(yīng)密不可分，可能參與了絨毛膜羊膜炎的發(fā)生，并在感染所致的PROM中發(fā)揮重要作用。

妊娠是一個(gè)復(fù)雜的免疫調(diào)控過程，炎癥是免疫紊亂發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制，iNOS在正常情況下呈低表達(dá)，當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)誘導(dǎo)iNOS表達(dá)產(chǎn)生NO，NO經(jīng)過多種途徑，在妊娠感染中調(diào)節(jié)殺菌機(jī)制，使胎兒在胎盤屏障破壞的情況下仍進(jìn)一步受到保護(hù)。當(dāng)炎癥因子持續(xù)存在時(shí)可使NO水平持續(xù)升高，引起炎癥級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)，將信號(hào)波及范圍擴(kuò)大，推動(dòng)炎癥發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)iNOS在胎膜中的炎性細(xì)胞中高表達(dá)，且iNOS在絨毛膜羊膜炎組孕婦胎膜中的表達(dá)水平明顯高于非絨毛膜羊膜炎組(P＜0.01)，說明iNOS與炎癥反應(yīng)密不可分，炎癥或感染可以導(dǎo)致iNOS的高表達(dá)，iNOS的高表達(dá)同時(shí)也促進(jìn)了絨毛膜羊膜炎的發(fā)生發(fā)展，使得妊娠期免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂導(dǎo)致胎膜早破的發(fā)生。

4 MMP－9、iNOS與PROM

近年來有學(xué)者［13］研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎著床期應(yīng)用NO抑制劑抑制NO的產(chǎn)生會(huì)影響MMP－2、MMP－9、TIMP－3的基因表達(dá)，從而導(dǎo)致影響胚胎著床，從而得出結(jié)論NO表達(dá)可能激活MMP表達(dá)。本研究中我們對(duì)60例孕婦胎膜中MMP－9和iNOS的表達(dá)進(jìn)行了Spearman秩相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)MMP－9與iNOS在胎膜中的表達(dá)水平呈正相關(guān)(P＜0.01)，說明MMP－9、iNOS二者在PROM發(fā)病中存在關(guān)聯(lián)，NO可能會(huì)激活胎膜中的MMP－9，參與胎膜的破裂。生理過程中，NO參與體內(nèi)環(huán)鳥苷酸的(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)的產(chǎn)生，所以 NO 可能會(huì)通過影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中cGMP的產(chǎn)生從而影響MMP－9的表達(dá)，另一方面，NO也可能通過影響其它細(xì)胞因子的表達(dá)間接影響MMP－9的表達(dá)及活性［14］，作為一種多功能分子，NO也可能直接參與MMP－9的表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，具體的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。Yuan等［15］實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)絨毛膜細(xì)胞iNOS的表達(dá)使NO產(chǎn)生增多，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致組織活性細(xì)胞減少，從而影響膠原纖維合成及細(xì)胞外基質(zhì)沉積，胎膜韌性下降，局部胎膜變薄導(dǎo)致胎膜破裂，故推斷NO與PROM的發(fā)病可能存在密切相關(guān)。

綜上所述，MMP－9和iNOS表達(dá)升高與pPROM及絨毛膜羊膜炎的發(fā)生相關(guān)，MMP－9和iNOS在PROM發(fā)病機(jī)制中存在關(guān)聯(lián)作用，如果通過選擇性的iNOS抑制劑干擾導(dǎo)致炎癥瀑布反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制iNOS過量表達(dá)而抑制過量NO的產(chǎn)生，可同時(shí)下調(diào) MMP－9的表達(dá)，有可能減少或預(yù)防PROM的發(fā)生。

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