劉曉燕， 戴愛(ài)國(guó)， 譚雙香

(1湖南省老年醫(yī)院－老年醫(yī)學(xué)研究所呼吸疾病研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410016;2南華大學(xué)研究生院，湖南 衡陽(yáng) 421001)

轉(zhuǎn)錄因子ATF3/ATF4屬于ATF/CREB轉(zhuǎn)錄因子家族，富含堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(basic leucine zippe，bZIP)，廣泛參與多種病理生理過(guò)程，如氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和免疫調(diào)節(jié)等。紅系衍生的核因子相關(guān)因子2(NF－E2－related factor 2，Nrf2)作為體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，對(duì)氧化應(yīng)激狀況下多種抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用，可有效緩解氧化損傷［1］。近來(lái)研究證實(shí)［2，3］，ATF3 和ATF4可協(xié)同Nrf2調(diào)控抗氧化反應(yīng)元件(anti－oxidant response element，ARE)依賴的Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表達(dá)，如γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞基(glutamyl－L－cysteine ligasecatalytic subuint，GCLC)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S－transferase，GST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase－1，HO－1)等。我室前期研究發(fā)現(xiàn)ATF3和ATF4在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)大鼠肺組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)［4］，但在 COPD患者中它們的研究較少。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察ATF3、ATF4和Nrf2在COPD患者中表達(dá)情況的變化，初步探討ATF3、ATF4與Nrf2之間的相互作用以及它們?cè)贑OPD氧化/抗氧化失衡中的可能作用。

材料和方法

1 材料

芙蓉牌香煙(湖南中煙工業(yè)公司，尼古丁1 mg/支，焦油 14 mg/支);脂多糖(LPS)Sigma;ATF3、ATF4、Nrf2兔多克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz;SP免疫組化試劑盒、ATF3、ATF4、Nrf2原位雜交試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;RIPA總蛋白提取試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、protein A+G agarose及ECL化學(xué)發(fā)光劑均購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所;BCA法蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物發(fā)展有限公司;蛋白電泳系統(tǒng)為Bio－Rad產(chǎn)品;小動(dòng)物肺功能測(cè)定系統(tǒng):HX200型呼吸流量換能器(北京新行興業(yè)科貿(mào)有限公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型復(fù)制及組織標(biāo)本制備 成年雄性SD大鼠22只(湖南中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物部提供，清潔級(jí))，平均體重(240±20)g，鼠齡10周，按隨機(jī)數(shù)字表法分COPD組和對(duì)照組，每組11只。用每日熏香煙，其中第1 d、14 d氣管內(nèi)滴LPS(1g/L)200 μL建立COPD大鼠模型［5］;對(duì)照組第1和14 d氣管內(nèi)注入生理鹽水200 μL，其余不作任何干預(yù)，兩組飼養(yǎng)條件相同。COPD模型組在第4 d死亡1只，原因不明。第28 d熏香煙后，兩組大鼠均用1%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉，操作步驟參照我室方法［5］用小動(dòng)物肺功能測(cè)定儀測(cè)定大鼠0.3 s用力呼氣容積(forced expiratory volume in first 0.3 s，F(xiàn)EV0.3)、0.3 s用力呼氣容積占用力肺活量的比值(percentage of forced ecpiratory volume in first 0.3 s to forcedvital capacity，F(xiàn)EV0.3/FVC)、呼氣峰流速(peak expiratory flow，PEF)，2 h內(nèi)將大鼠大動(dòng)脈放血處死，取右肺置于液氮中保存用于免疫共沉淀(co－immunoprecipitation，Co－IP)分析。

2.2 臨床組織標(biāo)本留取 肺組織標(biāo)本來(lái)自湖南省腫瘤醫(yī)院胸外科2008年12月－2009年12月因早期肺癌行肺葉切除術(shù)者40例，所有患者術(shù)前均詢問(wèn)病史，進(jìn)行體檢、X線胸片或肺部CT和肺功能檢測(cè)。COPD組20例:男15例，女5例，平均年齡(61±5)歲，臨床診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)2007年制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》標(biāo)準(zhǔn)［6］。第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比(percentage of forced expiratory volume in one second to predicted value，F(xiàn)EV1%pred)為(69.60±4.45)%，第1秒用力呼氣容積/用力肺活量(percentage of forced expiratory volume in first second to forced vital capacity，F(xiàn)EV1/FVC)為(66.46±3.00)%。肺標(biāo)本右下肺12例，左下肺8例。對(duì)照組20例:男17例，女3例，平均年齡(59±6)歲，F(xiàn)EV1%預(yù)計(jì)值為(84.95±3.69)%，F(xiàn)EV1/FVC為(83.15±3.40)%。肺標(biāo)本右下肺9例，左下肺11例。兩組年齡、性別及取材部位比較差異無(wú)顯著(均 P＞0.05)，F(xiàn)EV1%預(yù)計(jì)值、FEV1/FVC比較差異顯著(均P＜0.01)。受檢者均排除合并患有心、肝、腎等其它疾病，并排除支氣管擴(kuò)張癥、肺結(jié)核和其它可以影響肺功能的疾病。參照文獻(xiàn)［7］取材，標(biāo)本取材均遠(yuǎn)離癌組織5 cm以上，將肺組織于4%多聚甲醛(含1‰ DEPC)中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、保存，行免疫組化和原位雜交檢測(cè)各指標(biāo)的表達(dá)。

2.3 免疫組化檢測(cè) 操作步驟按SP染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，Ⅰ抗用PBS稀釋(稀釋比例分別為ATF31∶50;ATF41∶50;Nrf21∶50)，孵育Ⅰ抗均采取 4 ℃過(guò)夜。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，陽(yáng)性結(jié)果顯棕黃色。用顯微顯影系統(tǒng)(Olympus)采集和分析圖像:為了便于比較，隨機(jī)選擇內(nèi)徑為100－200 μm的細(xì)支氣管和肺泡區(qū)各3個(gè)視野(×200)以JD系列病理圖文形態(tài)分析系統(tǒng)(江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)測(cè)量并計(jì)算陽(yáng)性信號(hào)平均吸光度(A)值，取平均值作為每個(gè)樣本陽(yáng)性表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。

2.4 原位雜交檢測(cè) 地高辛標(biāo)記的多相寡核苷酸探針序列:ATF3 mRNA:(1)5'－CAGAA CAAGC ACCTC TGCCA CCGGA TGTCC TCTGC － 3'，(2)5'－TACAT GCTCA ACCTT CATCG GCCCA CGTGT ATTGT－3'，(3)5'－TTTAT CCAAC AGATA AAAGA AGGAA CATTG CAGAG－3';ATF4 mRNA:(1)5'－GATTG GATGT TGGAG AAAAT GGATT TGAAG GAGTT－3'，(2)5'－GATGA CACTT GTGAT CTCTT TGCCC CCCTA GTCCA －3'，(3)5'－ AGGTA CCGCC AGAAG AAGAG GGCGG AGCAG GAGGC－3';Nrf2 mRNA:(1)5'－AGCAG GACAT GGAGG AAGTT TGGCA GGAGG TATTT －3'，(2)5'－ GTAAA GCTTT CAACC AGAAG CACAC TGAAG GCACG － 3'，(3)5'－ATGAC TTCAA TGAAA TGATG TCCAA GGAGC AATTC－3'。操作步驟按原位雜交試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。檢測(cè)方法同上。

2.5 免疫共沉淀檢測(cè) 于液氮中取出大鼠肺組織按照RIPA總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。冰上裂解30 min，4℃12000×g離心5 min，收集上清，加入捕獲抗體(Nrf21∶200)，4 ℃輕搖孵育24 h，再加入20 μL protein A+G agarose，4℃緩慢搖動(dòng)2 h沉淀抗體結(jié)合復(fù)合物。4℃、2500×g離心5 min棄上清，加入PBS重懸洗滌3次，再加入適量1×SDS－PAGE電泳上樣緩沖液煮沸5 min，離心取上清，上樣，12%SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別用ATF3抗體(1∶200)、ATF4抗體(1∶200)室溫下?lián)u床孵育2 h，Ⅱ抗(1∶10000稀釋)室溫孵育1 h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光法膠片成像。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 大鼠肺功能及肺組織的病理改變

COPD組 大 鼠 FEV0.3、FEV0.3/FVC和 PEF［(2.25 ±0.14)mL、(62.09 ±1.30)% 和(20.60±1.88)mL/s］較對(duì)照組［(4.05 ± 0.24)mL、(81.10±1.82)% 和(39.48±2.77)mL/s］顯著降低(均P＜0.01);光鏡下觀察肺組織病理改變:與對(duì)照組比較，COPD組大鼠支氣管肺內(nèi)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮層、平滑肌層增厚;支氣管黏膜增厚、脫落，基底細(xì)胞排列紊亂，腺體增生肥大;終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端的氣囊腔膨脹擴(kuò)大，肺泡壁變薄，部分肺泡破裂融合成肺大泡，符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)2007年制定的標(biāo)準(zhǔn)［6］。

2 肺組織ATF3、ATF4和Nrf2 mRNA的表達(dá)

原位雜交結(jié)果(圖1)顯示:ATF3、ATF4和Nrf2 mRNA在2組患者肺組織中的表達(dá)部位基本一致，主要見(jiàn)于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞以及炎癥細(xì)胞中。ATF3、ATF4 mRNA在COPD組均顯著高于對(duì)照組(均P＜0.01)，兩組Nrf2 mRNA比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

3 肺組織中ATF3、ATF4和Nrf2蛋白的表達(dá)

免疫組化光鏡下見(jiàn)ATF3、ATF4、Nrf2蛋白主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞，小血管平滑肌中亦有少許表達(dá)，胞漿胞核均有免疫著色，以胞核表達(dá)為主，見(jiàn)圖2。ATF3、ATF4、Nrf2蛋白在COPD組均呈陽(yáng)性表達(dá)且顯著高于對(duì)照組(均P ＜0.01)，見(jiàn)表1。

4 Nrf2與ATF3、ATF4的相互作用

免疫共沉淀結(jié)果顯示ATF3、ATF4與Nrf2可雜交出明顯的蛋白條帶，見(jiàn)圖3，且COPD組顯著高于對(duì)照組(P ＜0.05)，提示 Nrf2與 ATF3、ATF4之間存在相互作用。

Figure 1.The expression of ATF3，ATF4 and Nrf2 mRNA in lung tissues of patients in each group(in situ hybridization，DAB，×200).A，C，E:control;B:ATF3 in COPD group;D:ATF4 in COPD group;F:Nrf2 in COPD group.圖1 兩組患者肺組織中ATF3、ATF4和Nrf2 mRNA的表達(dá)

Figure 2.The expression of ATF3，ATF4 and Nrf2 proteins in lung tissues of patients in each group(immunohistochemistry，DAB，×200).A，C，E:control;B:ATF3 in COPD group;D:ATF4 in COPD group;F:Nrf2 in COPD group.圖2 兩組患者肺組織中ATF3、ATF4和Nrf2蛋白的表達(dá)

表1 兩組COPD患者肺組織ATF3、ATF4、Nrf2 mRNA及蛋白的表達(dá)Table 1.The mRNA and protein expression of ATF3，ATF4 and Nrf2 in control patient and COPD patient lung specimens(.n=20)

表1 兩組COPD患者肺組織ATF3、ATF4、Nrf2 mRNA及蛋白的表達(dá)Table 1.The mRNA and protein expression of ATF3，ATF4 and Nrf2 in control patient and COPD patient lung specimens(.n=20)

＊＊P ＜0.01 vs control group.ISH:in situ hybridization;IHC:immunohistochemistry.

Group ATF3 ATF4 Nrf2 ISH IHC ISH IHC ISH IHC Control 0.18 ±0.06 0.20 ±0.04 0.17 ±0.05 0.19 ±0.04 0.16 ±0.04 0.20 ±0.05 COPD 0.31 ±0.05＊＊ 0.34 ±0.07＊＊ 0.25 ±0.05＊＊ 0.32 ±0.08＊＊ 0.18 ±0.03 0.37 ±0.07＊＊

Figure 3.Interactions of ATF3/ATF4 protein and Nrf2 protein in the rat lungs determined by co－immunoprecipitation..n=11.*P＜0.05 vs control group.圖3 免疫共沉淀檢測(cè)大鼠肺組織中Nrf2與ATF3、ATF4的相互作用

討 論

氧化失衡是COPD重要發(fā)病機(jī)制之一。機(jī)體在各種氧化應(yīng)激狀況下，體內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)增加，超出了抗氧化物質(zhì)的清除能力，導(dǎo)致氧化/抗氧化失衡，從而造成肺部損傷，氣流受限進(jìn)行性加重。近年發(fā)現(xiàn)，Nrf2是氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要轉(zhuǎn)錄激活因子，并在COPD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［8］。在靜息狀態(tài)下，Nrf2主要與 Keap1結(jié)合以失活的形式定位于胞漿;氧化應(yīng)激時(shí)Keap1失活而Nrf2通過(guò)各種信號(hào)通路激活移位入核，與其它bZIP因子如Jun、ATF4、小Maf蛋白等形成異二聚體結(jié)合于其下游的靶基因如γ－GCS、HO－1、NAD(P)H:醌氧化還原酶1［NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1］等基因調(diào)控序列的ARE上發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用［1，9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雖然Nrf2蛋白在COPD組表達(dá)明顯上調(diào)，以核內(nèi)表達(dá)為主;但Nrf2 mRNA在2組表達(dá)無(wú)顯著差異。考慮氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2與負(fù)調(diào)控子Keap1解離，Nrf2降解減少，蛋白穩(wěn)定性增加，激活的Nrf2移位入核影響其蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而在核內(nèi)發(fā)揮上調(diào)抗氧化基因表達(dá)的作用［5，10，11］。但目前對(duì)于 Nrf2 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制涉野較少，進(jìn)一步研究有助于為COPD的抗氧化失衡機(jī)制提供有力的理論依據(jù)及實(shí)踐意義。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激狀況下，轉(zhuǎn)錄因子ATF3基因缺失可導(dǎo)致體內(nèi)重要抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽(glutathione，GSH)合成減少，同時(shí)可降低Nrf2下調(diào)ROS的水平，增加DNA損傷;但ATF3基因缺失并不影響Nrf2對(duì)其下游靶基因如HO－1、硫氧還蛋白1(sulfiredoxin 1，SRXN1)、NQO1 等的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［11］。由此表明高表達(dá)的ATF3需與Nrf2相互作用，增強(qiáng)Nrf2對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的活性，從而降低機(jī)體氧化損傷。本研究結(jié)果顯示ATF3蛋白及 mRNA在COPD組均較對(duì)照組顯著增高，胞核表達(dá)為主，且其表達(dá)部位與Nrf2蛋白及mRNA表達(dá)部位基本一致，提示在COPD氧化應(yīng)激狀況下，ATF3表達(dá)反應(yīng)性明顯上調(diào)，且其基因表達(dá)與Nrf2轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。Kim等［12］在研究中證實(shí) ATF3啟動(dòng)子區(qū)域具有 ARE，Nrf2通過(guò)與之結(jié)合，從而調(diào)節(jié)ATF3基因表達(dá)。同時(shí)本研究中，免疫共沉淀顯示以Nrf2抗體捕獲的免疫沉淀中，ATF3抗體可雜交出明顯的蛋白條帶，并且這種結(jié)合在COPD組明顯增強(qiáng)，從而證實(shí)Nrf2與ATF3蛋白之間存在直接相互作用。據(jù)以往報(bào)道，ATF3常常通過(guò)其bZIP區(qū)域與Nrf2形成異二聚體調(diào)控抗氧化基因表達(dá)，如 GCLC、GST等［2］。因此綜合以上研究成果，我們推測(cè)氧化應(yīng)激時(shí)ATF3表達(dá)上調(diào)，通過(guò)與核轉(zhuǎn)位的Nrf2形成異二聚體，增強(qiáng)Nrf2的結(jié)合活性，可能轉(zhuǎn)錄調(diào)控Nrf2下游抗氧化酶基因的表達(dá)，在COPD氧化/抗氧化失衡中發(fā)揮作用，但其中的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

氧化應(yīng)激目前是人類多種疾病重要的發(fā)病機(jī)制之一，胞內(nèi)氧化應(yīng)激的精確調(diào)節(jié)主要是通過(guò)應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子家族。既往研究表明，在氧化應(yīng)激下，ROS產(chǎn)生增多可活化PERK/eIF2α/ATF4通路，促進(jìn)GSH的合成，對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)性作用［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ATF4蛋白及mRNA在COPD組均較對(duì)照組顯著增高，以胞核表達(dá)為主，證實(shí)在氧化應(yīng)激狀況下，ATF4表達(dá)上調(diào)參與維持體內(nèi)氧化/抗氧化平衡。然而應(yīng)激狀況下ATF4表達(dá)上調(diào)的調(diào)控機(jī)制究竟如何呢?Afonyushkin等［14］發(fā)現(xiàn)，這其中包括兩個(gè)平行機(jī)制:(1)依賴于Nrf2與ATF4基因啟動(dòng)子區(qū)域ARE相結(jié)合的方式上調(diào)ATF4 mRNA水平;(2)與此相伴隨的是通過(guò)PERK途徑，eIF2α磷酸化，增強(qiáng)ATF4蛋白的合成。在本組實(shí)驗(yàn)中，我們也發(fā)現(xiàn)，ATF4表達(dá)部位與Nrf2蛋白及mRNA表達(dá)部位基本一致，佐證了Nrf2對(duì)ATF4表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。值得注意的是，ATF4和Nrf2之間是否還存在其它關(guān)聯(lián)?以往研究顯示［3］，ATF4能增強(qiáng)Nrf2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，形成ATF4·Nrf2異二聚體結(jié)合于抗氧化酶HO－1應(yīng)激反應(yīng)元件(stress response element，StRE)上，調(diào)控HO－1的表達(dá)。本研究利用Co－IP技術(shù)，顯示在ATF4與Nrf2蛋白之間存在直接相互作用關(guān)系，且COPD組明顯增強(qiáng)。由此我們推測(cè)，應(yīng)激狀況下ATF4可協(xié)同Nrf2對(duì)其下游靶基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原能力，從而對(duì)抗氧化損傷。

總之，我們的研究表明，在COPD的發(fā)病過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子ATF3、ATF4與Nrf2形成異二聚體，可能參與對(duì)下游抗氧化酶基因表達(dá)的調(diào)控，在COPD的氧化失衡機(jī)制中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，進(jìn)一步的深入研究可能會(huì)為COPD的防治提供新的途徑。

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