張培勝 邢邯英 野戰(zhàn)鷹 (河北省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 05005)

血紅素加氧酶(HO)是血紅素降解起始酶和限速酶，HO-1為其誘導(dǎo)型。研究表明HO-1及其催化產(chǎn)物一氧化碳、膽紅素等均在抗氧化過(guò)程中發(fā)揮積極作用〔1，2〕。內(nèi)毒素主要的致毒成分脂多糖(LPS)可以誘發(fā)多種炎性介質(zhì)釋放和自由基生成增加，直接造成組織細(xì)胞的氧化損傷〔3，4〕。本研究借助逆轉(zhuǎn)錄病毒將HO-1基因轉(zhuǎn)染入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304，觀察HO-1基因表達(dá)上調(diào)對(duì)內(nèi)毒素培養(yǎng)的ECV304細(xì)胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 鋅原卟啉(zinc protoporphyrin，Znpp-Ⅸ)，LPS均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。G418、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。乳酸脫氫酶(LDH)和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物試劑公司。

1.2 細(xì)胞系及其培養(yǎng) 已轉(zhuǎn)染人HO-1(hHO-1)cDNA全長(zhǎng)的雙噬性逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系PA317/hHO-1(逆轉(zhuǎn)錄病毒載體重組體XM6/hHO-1經(jīng)Lipofectin介導(dǎo)轉(zhuǎn)染入PA317細(xì)胞，同時(shí)帶有新霉素耐藥基因NeoR以用于選擇)〔5〕由首都醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物系安威教授惠贈(zèng)。PA317/hHO-1和小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM中，ECV304細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基(含D-葡萄糖5.5 mmol/L)中。

1.3 人血紅素加氧酶-1基因轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞 PA317/hHO-1復(fù)蘇、傳代后收集病毒上清。以NIH3T3為靶細(xì)胞測(cè)定病毒滴度為4×105CFU/ml。此滴度的病毒上清可以完全勝任離體情況下的基因轉(zhuǎn)染，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。2×105個(gè)ECV304細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，24 h后加入1 ml病毒上清及終濃度為8 μg/ml的polybrene于37℃培養(yǎng)6 h，然后加入3 ml新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。細(xì)胞傳代并加入500 μg/ml G418(敏感劑量)，篩選14天后得到抗性克隆，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)染細(xì)胞，命名為ECV/hHO-1。選取生長(zhǎng)良好且較為孤立的克隆，用胰蛋白酶消化后移到新的培養(yǎng)瓶中，擴(kuò)增備用。ECV304轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)過(guò) G418(500 μg/ml)連續(xù)2次篩選，ECV/hHO-1均能在含G418的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，而對(duì)照細(xì)胞則全部死亡。

1.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中血紅素加氧酶-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) Trizol一步法提取ECV304/hHO-1細(xì)胞和ECV304細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體積為25 μl，包括RNA 10 μg。取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，分別進(jìn)行hHO-1和內(nèi)參照β-actin基因的PCR擴(kuò)增。hHO-1的上、下游引物按照文獻(xiàn)〔5〕設(shè)計(jì)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描并進(jìn)行圖像分析。

提取ECV304/hHO-1細(xì)胞和ECV304細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。取100 μg蛋白經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。再分別與一抗(HO-1兔多克隆抗體按1∶1 500稀釋?zhuān)珿APDH單抗為1∶2 500稀釋)和二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或兔抗鼠I gG抗體按1∶2 000稀釋)4℃過(guò)夜和室溫孵育2 h、DAB顯色、照相、圖像分析儀分析結(jié)果。

1.5 LDH釋放率測(cè)定 ECV304及ECV/hHO-1細(xì)胞以1×105個(gè)/ml接種于24孔板。無(wú)血清DMEM處理24 h后，細(xì)胞分為3組:① 未轉(zhuǎn)染ECV304組;② ECV304/hHO-1組;③Znpp-Ⅸ(20 μmol/L)+ECV304/hHO-1組。每組細(xì)胞分別用含或不含LPS(5 mg/L)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)上清液。每孔加入0.5 ml細(xì)胞裂解液(1%曲拉通X-100，150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris HCl，1 mmol/L EDTA)，振蕩 20 min，收集細(xì)胞裂解液，用比色法測(cè)定每孔(n=6)培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液中的LDH活性。以培養(yǎng)上清液中LDH活性單位占培養(yǎng)上清液加細(xì)胞裂解液中LDH總活性單位的百分比作為L(zhǎng)DH釋放率。

1.6 MDA含量測(cè)定 細(xì)胞分組及處理因素同LDH釋放率測(cè)定。作用24 h后棄去上清，用PBS洗3次后每孔加入0.5 ml細(xì)胞裂解液，待細(xì)胞充分裂解后，參照MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定MDA含量。細(xì)胞蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0版統(tǒng)計(jì)分析軟件包處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)采用±s表示，多組計(jì)量資料顯著性檢驗(yàn)用單因素方差分析(ANOVA)和兩兩比較(LSD法)。

2 結(jié)果

2.1 血紅素加氧酶-1轉(zhuǎn)基因ECV304細(xì)胞的建立 RT PCR分析表明未被轉(zhuǎn)染的ECV304細(xì)胞hHO-1 mRNA表達(dá)量很低，而轉(zhuǎn)染hHO-1基因的ECV304表達(dá)量顯著升高(圖1)。Western印跡技術(shù)檢測(cè)ECV304細(xì)胞HO-1蛋白(32 kD)條帶較淺，而轉(zhuǎn)染細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，與ECV304細(xì)胞相比升高1.7倍，其IOD比值有顯著差異(圖2)。每種細(xì)胞GAPDH蛋白(36 kD)條帶表達(dá)水平相同，提示上樣量無(wú)差異。

2.2 LDH釋放率和細(xì)胞MDA含量 三組細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，LDH釋放率和細(xì)胞MDA含量相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在加用LPS(5 mg/L)培養(yǎng)24 h后，ECV304細(xì)胞LDH釋放率和MDA含量明顯增加 (P＜0.05);ECV304/hHO-1細(xì)胞組較ECV304細(xì)胞有所降低，兩者相比有顯著差異(P＜0.05)。在相同培養(yǎng)條件下加用Znpp-Ⅸ，ECV304/hHO-1細(xì)胞LDH釋放率和細(xì)胞MDA含量進(jìn)一步上升 (P＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 ECV304細(xì)胞和ECV304/hHO-1細(xì)胞HO-1 mRNA RT-PCR擴(kuò)增圖片

圖2 ECV304細(xì)胞和ECV304/hHO-1細(xì)胞HO-1蛋白Western印跡分析

表1 各組細(xì)胞LDH釋放率和MDA含量的變化(± s，n=6)

表1 各組細(xì)胞LDH釋放率和MDA含量的變化(± s，n=6)

與同組內(nèi)DMEM培養(yǎng)基比較:1)P＜0.05;與相同處理因素的ECV304組比較:2)P＜0.05;與相同處理因素的ECV304/hHO-1組比較:3)P＜0.05

組別 MDA含量(nmol/mg蛋白)DMEM培養(yǎng)基 DMEM培養(yǎng)基+LPS(5 mg/L)LDH釋放率(%)DMEM培養(yǎng)基 DMEM培養(yǎng)基+LPS(5 mg/L)ECV304組 0.62±0.11 1.54±0.071) 17.64±4.22 37.99±5.281)ECV304/hHO-1組 0.63±0.09 1.12±0.292) 15.82±4.81 22.10±3.772)ECV304/hHO-1+ZnPP-Ⅸ 組 0.64±0.12 1.95±0.223) 18.37±5.33 48.31±4.483)

3 討論

HO是參與血紅素降解的重要酶類(lèi)之一，在微粒體還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-細(xì)胞色素P450還原酶協(xié)同參與下形成一個(gè)短暫的電子傳遞鏈，其主要功能是分解血紅素的四吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)從而生成等摩爾的游離鐵、一氧化碳和膽綠素，而膽綠素在膽綠素還原酶的催化下迅速轉(zhuǎn)化為膽紅素。HO-1屬誘導(dǎo)型，正常情況下在大多數(shù)組織中表達(dá)量很低(只在脾、肝臟和睪丸中有較高表達(dá))，但多種應(yīng)激性因素可以誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)和活性增強(qiáng)，如內(nèi)毒素、高(低)氧、紫外線(xiàn)、重金屬和血紅素等〔6～8〕。大量研究證實(shí)上調(diào)HO-1的表達(dá)可以保護(hù)組織細(xì)胞、對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷。據(jù)此我們推測(cè)如果能夠人為地增加HO-1的表達(dá)水平將有助于提高ECV304細(xì)胞抗氧化損傷能力，發(fā)揮保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中與LPS共培養(yǎng)的ECV304細(xì)胞MDA含量和LDH釋放率均增加，兩者變化相一致。LDH是能量代謝中的一種重要酶類(lèi)，廣泛存在于各類(lèi)組織細(xì)胞，其釋放率可用來(lái)衡量細(xì)胞受損程度，而MDA是氧自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化所形成的產(chǎn)物，其含量可以反映組織氧化損傷程度，這一結(jié)果提示氧化損傷在LPS致細(xì)胞損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。ECV304細(xì)胞在轉(zhuǎn)染HO-1后，可以有效地降低氧化應(yīng)激水平，而應(yīng)用Znpp-Ⅸ可抑制HO-1活性，加重細(xì)胞的損傷。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染是基因治療的方法之一，雖然病毒滴度低于腺病毒載體，但對(duì)人體相對(duì)安全，不會(huì)造成全身性病毒感染的后果;而且能穩(wěn)定地整合到宿主基因組，并將目的DNA傳遞給整個(gè)細(xì)胞群體，不會(huì)隨著細(xì)胞的分裂而丟失。本實(shí)驗(yàn)借助逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將外源性HO-1基因?qū)隕CV304細(xì)胞，結(jié)果表明目的基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)量增高，而且傳代后維持高表達(dá)水平。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體尤其是雙嗜性病毒時(shí)，生物學(xué)安全問(wèn)題是不容忽視的。逆轉(zhuǎn)錄病毒雖能將目的基因有效的整合入宿主細(xì)胞基因組中，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，但是這種整合是隨機(jī)的，目的基因表達(dá)的穩(wěn)定性與插入的位點(diǎn)、方向及周?chē)虻榷喾N因素有關(guān)，同時(shí)基因的插入對(duì)目的細(xì)胞的其他生物學(xué)行為的影響也缺乏更多的證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)僅限于細(xì)胞水平上一個(gè)初步的、探索性的基因治療試驗(yàn)，在整體情況下細(xì)胞可處于不同的分裂期，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染分裂期細(xì)胞，而且易被體內(nèi)補(bǔ)體所滅活，轉(zhuǎn)染效率很低。如何確保逆轉(zhuǎn)錄病毒使用的安全性和增強(qiáng)在體轉(zhuǎn)染的效率將會(huì)是今后工作的重點(diǎn)。

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