周少丞 韓曉明 王力冬 康 琦 燕 鬧 于永春 歐 芹
(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)
許多學(xué)者已將腦內(nèi)乙酰膽堿 (Ach)的含量、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶 (ChAT)活性和膽堿酯酶 (AchE)活性作為人類腦功能衰老研究的主要指標,也作為探討阿茨海默病 (AD)藥物治療機制的重要方面〔1,2〕。目前研究表明,Ach代謝失調(diào)所致生化改變是中樞神經(jīng)系統(tǒng)衰老的重要因素之一〔3,4〕。山茱萸多糖是山茱萸的主要成分,具有提高衰老小鼠抗氧化能力、降低一氧化氮 (NO)及其合酶 (NOS)及白細胞介素-6(IL-6)水平,提高IL-1、IL-2水平的作用〔5,6〕;體外實驗證實其還能顯著降低衰老人胚肺二倍成纖維 (HDF)細胞β-半乳糖苷酶、P16、細胞周期蛋白因子-1(cyclinD1)的表達,提高熱休克蛋白70(HSP70)、周期素依賴性激酶4(CDK4)表達水平,減輕細胞DNA損傷〔7,8〕。本實驗旨在探討D-半乳糖衰老模型大鼠神經(jīng)生長因子 (NGF)和AchE活性的變化,以及山茱萸多糖對抗腦衰老作用的機制。
1.1 藥品與試劑 山茱萸購自佳木斯寶泰醫(yī)藥大藥房,由本校生藥教研室鑒定。腦脂褐素(LP)和AchE測試盒為南京建成生物公司產(chǎn)品,RT-PCR試劑盒為大連寶生物有限公司提供,引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。山茱萸多糖的制備參照李平等〔9〕方法,采用苯酚-硫酸法測定多糖含量,并制成0.05 g/ml的水溶液備用。
1.2 方法
1.2.1 動物分組與處理 純系Wistar大鼠46只,雌雄各半,2~3月齡,體重(225±25)g,由佳木斯大學(xué)動物實驗中心提供。隨機分為3組,青年對照組(QN,12只)、衰老模型組(SL,12只)、山茱萸多糖給藥組24只,其中給藥組分為小劑量組(FCPS,12只)和大劑量組(FCPL,12只),大鼠適應(yīng)2 w后開始實驗。QN每日上午側(cè)腹部皮下注射生理鹽水,劑量參照其他給藥組 D-半乳糖給藥量,SL和給藥組按48 mg·kg-1·d-1皮下注射D-半乳糖42 d后,SL經(jīng)胃給予相當(dāng)于給藥組藥量體積的溫開水,F(xiàn)CPS和FCPL分別按照0.14 g/kg體重、0.28 g/kg體重經(jīng)胃給藥,連續(xù)給藥30 d。于末次給藥后次日處死大鼠,4℃取腦皮質(zhì),分兩份分別用于制備10%組織勻漿和液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 指標檢測 LP采用熒光分光光度法,考馬斯亮藍法測蛋白質(zhì)含量,LP以μg/g組織表示。AchE活性采用分光光度法,以U/mg蛋白表示。Trizol常規(guī)提取總RNA,瓊脂糖電泳法檢測RNA完整性,Beckman DU-800紫外檢測RNA含量。RTPCR法檢測NGF mRNA表達,以β-肌動蛋白(β-actin)作內(nèi)參,反轉(zhuǎn)錄條件:52℃ 30 min,99℃ 5 min,5℃ 5 min,1 個循環(huán);然后行 PCR。NGF上游引物:5'-GATCGGCGTACAGGCAGAAC-3',下游引物:5'-GGCTCGGCACTTGGTCTCAA-3',擴增片段長度504 bp;β-actin引物:上游引物:5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3',下游引物:5'-TTCCCATTCTCAGCCTTGAC-3',擴增片段長度207 bp。PCR反應(yīng)體系:5×PCR 緩沖液 10 μl,滅菌蒸餾水32.75 μl,Taq 酶 0.25 μl,上游引物和下游引物各 1 μl,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 5 μl;PCR 條件:94℃ 2 min ,1個循環(huán);94℃ 30 s,58℃30 s,72℃ 1 min,29個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠80 V電泳1.2 h,溴乙錠(EB)染色,采用凝膠成像系統(tǒng)分析,以O(shè)DNGF/ODβ-actin表示NGF mRNA表達水平。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件,實驗數(shù)據(jù)以±s表示,數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用方差分析,組間比較采用t檢驗。
2.1 山茱萸多糖對衰老模型大鼠腦LP含量和AchE活性的影響 SL和給藥組大鼠LP含量均明顯高于QN(P<0.01);兩給藥組LP均較SL大鼠明顯降低(P<0.05,P<0.01);其中FCPL與FCPS有顯著差異(P<0.05)。SL大鼠AchE活性顯著升高(P<0.01);兩給藥組AchE明顯低于SL大鼠(P<0.05,P<0.01),其中FCPL降低更顯著(P<0.01);SL、FCPS和FCPL大鼠AchE活性明顯高于QN大鼠(P<0.01,P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。
2.2 D-半乳糖對大鼠腦NGF表達的影響及山茱萸多糖的作用 SL和FCPL、FCPS大鼠腦皮層NGF mRNA表達(0.426±0.056,0.537±0.047,0.615±0.051)均明顯低于 QN(0.728 ±0.071)(P <0.01,P <0.05);而 FCPL、FCPS則明顯高于 SL(P<0.01,P<0.05),其中以 FCPL組表達降低較顯著(P<0.05)。見圖1。
表1 山茱萸多糖對衰老模型大鼠LP含量和AchE活性的影響(±s)
表1 山茱萸多糖對衰老模型大鼠LP含量和AchE活性的影響(±s)
與青年組比較:1)P<0.05,2)P<0.01;與衰老模型組比較:3)P<0.05,4)P <0.01;與小劑量組比較:5)P <0.05,6)P <0.01
組別 n LP(μg/g組織) AchE(U/mgpro)青年對照組(QN)12 1.329±0.128 0.463 ±0.056衰老模型組(SL) 10 2.505±0.3142) 0.752±0.0472)小劑量組(FCPS) 12 1.951±0.1752)4) 0.687±0.0632)3)大劑量組(FCPL) 12 1.653±0.1761)4)5) 0.532±0.0462)4)6)
圖1 各組大鼠腦NGF mRNA表達
本研究結(jié)果說明衰老模型大鼠腦組織NGF mRNA水平較青年對照組降低,而AchE活性和LP水平增高,說明D-半乳糖可能通過誘導(dǎo)大鼠細胞代謝障礙或DNA損傷,導(dǎo)致自由基代謝紊亂,LP積累過多,后者可通過破壞磷脂膜結(jié)構(gòu),導(dǎo)致線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少以及空泡形成等亞細胞結(jié)構(gòu)的變化,并使神經(jīng)元數(shù)目減少。而神經(jīng)元數(shù)量的減少進一步導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能的減退〔10〕。同時AchE活性的升高必然導(dǎo)致Ach降解加速,引起腦功能的減退。也有研究者發(fā)現(xiàn),腦功能的減退與NGF受體脫失,膽堿能神經(jīng)元對NGF攝入量減少有關(guān)。由靶區(qū)(海馬及新皮質(zhì))產(chǎn)生的NGF可經(jīng)逆行運輸?shù)街袠猩窠?jīng)系統(tǒng)基底前腦膽堿能神經(jīng)元胞體,發(fā)揮其靶源性營養(yǎng)作用。有研究提出膽堿能神經(jīng)元亞群在學(xué)習(xí)和記憶中具有特殊功能〔3〕。而山茱萸多糖能抑制腦內(nèi)LP的積累,從而使腦組織損傷終止并逐漸修復(fù),提高老齡小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。山茱萸多糖還通過上調(diào)NGF表達增加內(nèi)源性NGF的含量,促進神經(jīng)支配區(qū)的膽堿能纖維數(shù)量增加和單個軸突末梢形成較多的突觸,有助于神經(jīng)元損傷后功能的迅速恢復(fù)。此外,山茱萸多糖還抑制AchE的活性,可通過減少Ach的分解、增加其合成和釋放這一過程而實現(xiàn)。
綜上所述,山茱萸多糖可抑制衰老模型大鼠腦脂質(zhì)過氧化,上調(diào)NGF基因表達,提高AchE活性,進而改善衰老模型大鼠的腦功能,且山茱萸多糖大劑量的效果好于小劑量。
1 Ballard C,Gauthier S,Corbett A,et al.Alzheimer's disease〔J〕.Lancet,2011;377(9770):1019-31.
2 Hicks D,John D,Makova NZ,et al.Membrane targeting,shedding and protein interactions of brain acetylcholinesterase〔J〕.J Neurochem,2011;116(5):742-6.
3 Swaab DF,Bao AM.Reactivation of neurons in aging and dementia:lessons from the hypothalamus〔J〕.Exp Gerontol,2011;46(2-3):178-84.
4 Lester DB,Rogers TD,Blaha CD.Acetylcholine-dopamine interactions in the pathophysiology and treatment of CNS disorders〔J〕.CNS Neurosci Ther,2010;16(3):137-62.
5 張玉成,歐 芹,魏曉東,等.山茱萸多糖對D-半乳糖致衰小鼠IL-1、IL-2、IL-6以及NO、NOS作用的實驗研究〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2008;28(4):350-2.
6 金 紅,歐 芹,王迪迪.山茱萸多糖對衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響的研究〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2009;29(12):1467-9.
7 張慧丹,孫 潔,歐 芹,等.衰老HDF細胞DNA損傷與Hsp70 mRNA表達及山茱萸多糖的作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2009;29(16):2007-9.
8 歐 芹,黃秋實,張慧丹,等.不同濃度對HDF細胞衰老的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2010;30(7):924-6.
9 李 平,王艷輝,馬潤宇.山茱萸多糖提取過程研究〔J〕.北京化工大學(xué)學(xué)報·自然科學(xué)版,2003;30(1):13-6.
10 姚 潔,盛樹力,閔 榮,等.APP17肽對D-半乳糖老化小鼠海馬神經(jīng)元IRS和PI3K表達的影響〔J〕.中國藥理學(xué)通報,2007;23(1):95-9.