范曉艷 劉 娜 金岳雷 朱金玲 呂冬霞 (佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 54007)

化療是宮頸癌較為傳統(tǒng)的治療方法，傳統(tǒng)的化療藥物有不同程度的毒副作用，長(zhǎng)期應(yīng)用后其毒副作用給患者帶來(lái)極大的痛苦甚至危及生命〔1～3〕。尋找毒性小、藥物不良反應(yīng)少且有一定療效的藥物治療腫瘤成為腫瘤治療的途徑之一。研究表明，灰樹(shù)花多糖(Polysaccharide of grifola frondosa，PGF)具有穩(wěn)定血壓、降低血糖、改善脂肪代謝、增強(qiáng)免疫功能、抑制腫瘤、抗HIV病毒等生理活性〔4〕。本實(shí)驗(yàn)探討PGF對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響，為抗腫瘤天然藥物的開(kāi)發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌HeLa細(xì)胞購(gòu)于武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物冷藏中心。凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó))，倒置相差顯微鏡(日本)，酶標(biāo)儀(LABSYSTEMS)，小牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液(杭州四季青)，二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)(上海普飛生物技術(shù)有限公司)，PGF粉末(浙江方格藥業(yè)有限公司)，順鉑粉劑(山東齊魯制藥廠)，半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)免疫組化試劑盒(武漢博士德生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代 配制含10%滅活小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液。將宮頸癌HeLa細(xì)胞按1×105個(gè)/ml的濃度分別接種在含完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，5%CO2，37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2～3 d傳代一次，所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行。

1.2.2 藥物配制 供試藥物均用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配制。PGF設(shè) 3個(gè)濃度:0.01、0.05、0.10 mg/L。順鉑:1 mg/L。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞按1×104個(gè)/ml的密度移入96孔培養(yǎng)板，每孔加入200 μl細(xì)胞懸液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，棄去原培養(yǎng)液，每孔加入不同濃度的 PGF溶液200 μl，其終濃度分別為0.01、0.05、0.10 mg/L;空白對(duì)照組中僅加10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。

每個(gè)濃度設(shè)立8個(gè)復(fù)孔，把培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h。經(jīng)過(guò) 12、24、48 h 后分別加入 MTT(5 mg/L)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔再加入 150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上，選擇490 nm波長(zhǎng)，以空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔吸光度值(OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%

1.2.4 蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察凋亡細(xì)胞形態(tài) 將用多聚賴氨酸處理的蓋玻片置于6孔板中，按1×105個(gè)/ml濃度接種細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的PGF溶液，分別于12、24、48 h進(jìn)行常規(guī)HE染色。在顯微成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.2.5 免疫組化方法檢測(cè)caspase-3蛋白的表達(dá) 免疫組化用常規(guī)鏈酶親合素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(SABC)法，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。鏡下觀察細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或褐色為caspase-3表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞。顯微鏡下每個(gè)區(qū)域選取不重復(fù)的隨機(jī)10個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，求平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，參數(shù)統(tǒng)計(jì)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PGF對(duì)HeLa細(xì)胞的體外抑制率 MTT結(jié)果顯示，PGF對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用均有明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系。見(jiàn)表1。

表1 PGF對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率(%，，n=8)

表1 PGF對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率(%，，n=8)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

劑量(mg/L)抑制率對(duì)照組12 h OD值 抑制率24 h OD值 抑制率48 h OD值1.056±0.098 － 1.016±0.054 － 0.932±0.039 －0.01 0.973±0.056 7.86 0.889±0.0281)12.50 0.756±0.0371)18.88 0.05 0.881±0.0221)16.57 0.768±0.0322)24.41 0.654±0.0512)29.83 0.10 0.711±0.0682)32.67 0.623±0.0502)38.68 0.512±0.0482)45.06

2.2 PGF對(duì)Hela細(xì)胞形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下觀察HE染色細(xì)胞，與對(duì)照組比較，PGF處理組可見(jiàn)典型的細(xì)胞體積縮小、變圓皺縮，細(xì)胞核深染，染色質(zhì)濃縮和斷裂。

2.3 免疫組化法檢測(cè)caspase-3的表達(dá) PGF促進(jìn)Hela細(xì)胞的caspase-3高表達(dá)，其作用呈一定的濃度和時(shí)間依賴性。見(jiàn)表2。

表2 PGF對(duì)Hela細(xì)胞caspase-3表達(dá)的影響(%，)

表2 PGF對(duì)Hela細(xì)胞caspase-3表達(dá)的影響(%，)

9.33±1.52 10.11±1.67 10.46±1.50 0.01 mg/L 12.90±2.711) 12.58±1.451) 14.76±1.841)0.05 mg/L 24.76±1.972) 33.61±3.352) 38.65±3.132)0.10 mg/L 37.16±2.932) 38.93±3.622) 49.85±3.312)12 h 24 h 48 h對(duì)照組組別

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用MTT法觀察 PGF作用于 HeLa細(xì)胞12、24、48 h后的抑制率，結(jié)果表明，PGF對(duì)HeLa細(xì)胞具有一定抑制作用，其抑制率呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性。HE染色觀察到典型的凋亡細(xì)胞。caspase-3是caspase家族中的成員，位于細(xì)胞凋亡caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，通過(guò)下游效應(yīng)因子切斷細(xì)胞間的信號(hào)傳遞，誘導(dǎo)形成凋亡小體，執(zhí)行凋亡功能〔5〕。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)了PGF作用12、24、48 h后HeLa細(xì)胞的caspase-3蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，PGF促進(jìn)Hela細(xì)胞的caspase-3高表達(dá)，其作用呈一定的濃度和時(shí)間依賴性，表明PGF誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與促進(jìn)caspase-3高表達(dá)有關(guān)。

大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，許多真菌多糖如香菇多糖、云芝多糖等具有抗腫瘤作用，有研究顯示PGF對(duì)S180肉瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用〔6〕。本研究進(jìn)一步證實(shí)了PGF在體外能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用，其作用機(jī)制可能與caspase-3高表達(dá)有關(guān)。

1 Leyvraz S，Ohnuma T，Lassus M，et al.Phase I study of carboplatin in patients with advanced cancer intermittent intravenous bolus，and 24-hour infusion〔J〕.J Clin Oncol，1985;3(10):1385-92.

2 Maines MD，Mayer RD.Inhibition of testicular cytochrome P-450-dependent steroid biosynthesis by cis-platinum.Reversal by human chorionic gonadotropin〔J〕.J Biol Chem，1985;260(10):6063-8.

3 Gandara DR，DeGregorio MW，Wold H，et al.High-dose cisplatin in hypertonic saline:reduced toxicity of a modified dose schedule and correlation with plasma pharmacokinetics.A Northern California Oncology Group Pilot Study in non-small-cell lung cancer〔J〕.J Clin Oncol，1986;4(12):1787-93.

4 Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential〔J〕.Altern Med Rev，2001;6(1):48-60.

5 Nicholson DW，Thornberry NA.Caspases:killer proteases〔J〕.Trends Biochem Sci，1997;22(8):299-306.

6 杜景衛(wèi)，夏作理，李清初，等.灰樹(shù)花多糖抗S180肉瘤的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005;26(2):95-8.