姜 波,王 紅,劉布駿

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,江蘇南京,210008)

韋格納肉芽腫(WG)為一種累及全身多個(gè)器官包括上/下呼吸道和腎臟系統(tǒng)的壞死性肉芽腫血管炎,盡管在我國(guó)發(fā)病率不高,但嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及生存率。目前,WG的病理機(jī)制尚不明確。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),新的T細(xì)胞亞群-IL-17產(chǎn)生細(xì)胞(Th17)在很多自身免疫病中有重要的參與作用。Th17不同于Th1和Th2,產(chǎn)生標(biāo)志性的細(xì)胞因子IL-17,與細(xì)胞的表面受體-IL-17RA/RC結(jié)合,誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的募集及淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化而參與免疫反應(yīng)。已發(fā)現(xiàn)IL-17在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[1]、多發(fā)性硬化[2]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[3]、大動(dòng)脈炎[4]和炎性腸病[5]患者中的表達(dá)顯著升高。Abdulahad等研究表明,與正常人相比,WG患者外周血Th17(IL-4、IL-17、IFN-γ)比例顯著升高,WG的自身抗原-胰蛋白酶3(PR3)刺激后,ANCA陽(yáng)性患者外周血Th17的比例顯著升高,提示IL-17參與WG的病理?yè)p害,且與ANCA的產(chǎn)生相關(guān)[6],但具體機(jī)制不明?？紤]到WG的血管炎損傷主要由循環(huán)中大量的自身抗體PR3-ANCA介導(dǎo),后者由B細(xì)胞分化的漿細(xì)胞產(chǎn)生。在其他自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡中,已證實(shí)IL-17與自身抗體-抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體[7]和抗組蛋白抗體[8]的產(chǎn)生相關(guān)。因此WG患者體內(nèi)Th17產(chǎn)生的IL-17可能通過(guò)與其下游B細(xì)胞表面IL-17受體-IL-17R結(jié)合后誘導(dǎo)后者產(chǎn)生自身抗體-ANCA而發(fā)揮病理作用。至今IL-17R在WG患者體內(nèi)特別是淋巴細(xì)胞上的表達(dá)尚無(wú)相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)檢測(cè)IL-17R在WG患者外周血免疫細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞(PMN)、單核細(xì)胞(Mono)、總淋巴細(xì)胞(Lym),特別是B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞上的表達(dá)有無(wú)異常,探索WG的病理機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

20例符合1990年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)分類標(biāo)準(zhǔn)的WG患者,6例為非活動(dòng)期患者,伯明翰血管炎活動(dòng)性評(píng)分BVAS3[9]=0分。14例活動(dòng)期患者,BVAS3均大于 0分,其中環(huán)磷酰胺(Cyc)治療組6例,甲氨喋呤(MTX)治療組8例。20例性別和年齡相匹配的正常人(HC)作為對(duì)照。

1.2 試劑

流式細(xì)胞儀所用熒光標(biāo)記的小鼠抗人單抗如下:APC標(biāo)記的抗IL-17R和同型對(duì)照IgG1,FITC標(biāo)記的抗CD38、FITC標(biāo)記的抗 CD20和同型對(duì)照IgG1,PE標(biāo)記的抗CD19同型對(duì)照IgG1,以及紅細(xì)胞裂解液,均購(gòu)自BD Pharmigen公司。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-17R表達(dá)

取5 mL EDTA抗凝的靜脈血,1 200轉(zhuǎn)/min室溫離心10 min,PBS洗滌3次。細(xì)胞沉淀以100 μ L PBS重懸,分別加入流式抗體APC-抗IL-17R+PE-抗FITC-抗CD38,APC-抗 IL-17R+PE-抗FITC-抗 CD20,同型對(duì)照APC-IgG1+PE-IgG1+FITCIgG1,4℃避光孵育30 min。1.5 mL紅細(xì)胞裂解液在4℃避光孵育10 min,1 200轉(zhuǎn)/min 4℃離心10 min,棄上清,細(xì)胞重懸于500 μ L流式緩沖液中。FACS Calibur(BD Bioscience)流式細(xì)胞儀檢測(cè),CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 比較IL-17R在WG患者和正常人外周血免疫細(xì)胞上的表達(dá)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)了IL-17R在WG患者(n=20)和正常人(n=20)外周血PMN、單核細(xì)胞、總淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞上的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),IL-17R在WG患者和正常人PMN、單核細(xì)胞、總淋巴細(xì)胞上的表達(dá)無(wú)顯著差異,但在WG患者B淋巴細(xì)胞(P<0.05)和漿細(xì)胞(P<0.05)上的表達(dá)顯著高于正常人。

2.2 比較IL-17R在活動(dòng)期與非活動(dòng)期WG患者外周血免疫細(xì)胞上的表達(dá)

根據(jù)BVAS3評(píng)分將WG患者分為活動(dòng)期(n=14,BVAS3>0分)與非活動(dòng)期(n=6,BVAS3=0分),流式細(xì)胞儀比較了IL-17R在2組患者外周血免疫細(xì)胞包括B淋巴細(xì)胞以及漿細(xì)胞上的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),活動(dòng)期與非活動(dòng)期WG患者中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和總淋巴細(xì)胞表面 IL-17R的表達(dá)無(wú)差異,與非活動(dòng)期患者相比,活動(dòng)期患者IL-17R在B淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞上的表達(dá)有下降趨勢(shì),但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異。

2.3 比較IL-17R在CyC與MTX治療組WG患者外周血免疫細(xì)胞上的表達(dá)

流式細(xì)胞儀比較了IL-17R在Cyc(n=6)和MTX(n=8)治療組患者外周血中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、總淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞上的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)于各種免疫細(xì)胞包括不同發(fā)育階段B細(xì)胞,IL-17R的表達(dá)在2個(gè)治療組間均無(wú)顯著性差異,見(jiàn)表1。

表1 IL-17R在各治療組WG患者外周血免疫細(xì)胞上的陽(yáng)性率(%)

3 討 論

IL-17的生理功能主要是作為促炎因子發(fā)揮作用,例如刺激IL-6、一氧化氮和前列腺素E2(PGE2)的產(chǎn)生[10],還可協(xié)同其他炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α和IFN-γ[11]等加劇及放大局部炎癥反應(yīng),以及介導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞趨化至炎癥部位[12]。研究發(fā)現(xiàn)IL-17參與很多自身免疫病[1-5],其作用機(jī)制不明,可能與其誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生相關(guān)[7-8]。David等研究發(fā)現(xiàn),在腎小球腎炎模型鼠-BXD2中,IL-17可直接作用于生發(fā)中心的B細(xì)胞,促進(jìn)其發(fā)育、遷移及分化為抗體產(chǎn)生細(xì)胞[13]。IL-17在韋格納肉芽腫病理機(jī)制中的參與作用尚屬初步探索階段。如前所述,WG患者體內(nèi)外周血中Th17及IL-17增多,自身抗體ANCA陽(yáng)性的患者Th17升高更為明顯[6],故推測(cè)IL-17可能誘導(dǎo)漿細(xì)胞產(chǎn)生ANCA。因此,有必要檢測(cè)WG患者體內(nèi)不同發(fā)育階段的B淋巴細(xì)胞特別是漿細(xì)胞表面IL-17受體-IL-17R的表達(dá)是否存在異常。

作者實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),IL-17R在WG患者外周血B淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞表面的表達(dá)顯著高于正常人,提示與正常人相比,IL-17對(duì)WG患者B細(xì)胞發(fā)育的初始階段及分化為抗體產(chǎn)生細(xì)胞終末階段的作用均顯著增強(qiáng),這與WG患者體內(nèi)增多的Th17比例及 IL-17濃度一致,即Th17通過(guò)產(chǎn)生IL-17與B細(xì)胞表面IL-17R相互作用,進(jìn)一步啟動(dòng)下游信號(hào)如抗體產(chǎn)生等參與WG發(fā)病。有趣的是,活動(dòng)期WG患者B淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞表面IL-17R的表達(dá)并不高于非活動(dòng)期患者,甚至有下降趨勢(shì),原因尚不明確,可能的機(jī)制為活動(dòng)期患者為控制病情,采用較強(qiáng)的免疫抑制劑聯(lián)合治療,甚至使用藥物的沖擊劑量,而緩解期患者多采用一種緩和的免疫抑制劑維持,免疫抑制劑的藥理作用可能抑制了B淋巴細(xì)胞表面 IL-17R的表達(dá),這尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定。

因IL-17還可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞趨化至炎癥反應(yīng)部位,作者還比較了IL-17R在WG患者和正常人群的這2種細(xì)胞表面的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),無(wú)論是WG患者和正常人之間,還是活動(dòng)期與非活動(dòng)期WG患者間,IL-17R在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的表達(dá)均無(wú)顯著差異,提示IL-17可能通過(guò)其他途徑參與WG的炎癥進(jìn)展。

為探索不同治療藥物對(duì)IL-17R的影響,作者還檢測(cè)了WG常用的免疫抑制劑-環(huán)磷酰胺和甲氨蝶呤治療組外周血中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞上IL-17R的表達(dá)。結(jié)果顯示,兩個(gè)治療組間無(wú)明顯差異,提示在這兩種免疫抑制劑的療效差異中,IL-17R的表達(dá)并非決定因素。

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