邵維斌,彭淑娟,夏春英,李 忻,荀 康

(江蘇省鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院腎臟內科,江蘇鎮(zhèn)江,212002)

腹膜纖維化和大量新生血管形成是導致長期腹膜透析患者腹膜功能衰竭的主要原因[1-2]。隨著腹膜透析的進行,非生理性透析液尤其是晚期糖基化終產物(advanced glycation end products,AGEs)、葡萄糖降解產物等可引起腹膜間皮細胞逐漸喪失上皮細胞表型,如 E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、細胞角蛋白等表達下降,同時獲得肌纖維母細胞樣的特性,如 snail蛋白、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達上升,即發(fā)生上皮 -間葉轉化[3-4],這種發(fā)生 EMT的腹膜間皮細胞具有浸潤和遷移的能力,因而腹膜間皮細胞 EMT可能是導致腹膜纖維化和新生血管形成的關鍵環(huán)節(jié)[4-5],本研究建立了大鼠腹膜間皮細胞 EMT模型來探討腹膜間皮細胞 EMT在腹膜透析時腹膜損傷過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 原代大鼠腹膜間皮細胞的培養(yǎng)

大鼠腹膜間皮細胞分離、培養(yǎng)及鑒定[6],取第 3代細胞進行實驗。

1.2 分組

①對照組:正常的 M199培養(yǎng)基;② 40 mmol/L AGEs組:含 40 mmol/L AGEs-BSA(AGEs牛血清白蛋白,美國 Biovision公司)的M199培養(yǎng)基;③ 80 mmol/L AGEs組:含 80 mmol/L AGEs-BSA的 M199培養(yǎng)基;④牛血清白蛋白(BSA)組:含 80 mmol/L BSA的 M199培養(yǎng)基。第 3代大鼠腹膜間皮細胞經(jīng)上述各組培養(yǎng)基培養(yǎng) 48、72 h后收集細胞,分別提取 RNA、蛋白。

1.3 實時定量 PCR檢測 E-cadherin、α-SMA、Collagen I、TGF-β1、VEGF mRNA的表達

細胞總 RNA抽提按 Trizol試劑盒的方法進行,運用實時定量 PCR試劑盒(德國 Qiagen公司)檢測,反轉錄 50℃、20 min,E-cadherin引物序 列 :正 義鏈 5′-ACCCCTGTTGGTGTCTTT-3′,反義鏈 5′-TTCGGGCTTGTTGTCATTC T-3′。 α-SMA引物序列:正義鏈 5′-GCTCTGTAAGGCGGGCTTTG-3′,反義鏈 5′-ACGA AGGAATAGCCACGCTCA-3′。 CollagenI引物序列 :正義鏈 5′-GGTAACGATGGTGCTGTCG G-3′,反義鏈 5′-GGGACCTTGAACTCCAGCAG-3′。TGF-β1引物序列:正義鏈 5′-CGAGGTGACCTGGGCACCATCC-3′, 反義鏈 5′-CTGTGCTATTGCCTTGTC-3′。 VEGF引物序列:正義鏈 5′-TTACTGCTGTACCTCCAC-3′, 反義鏈 5′-ACAGGACGGCTTGAAGATA-3′。 GAPDH引物序列:正義鏈 5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′, 反義鏈 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。 HotStarTaq DNA多聚酶激活 95℃、15 min,E-cadherin反應條件:94℃變性 30 s,55℃退火30 s,72℃延伸 45 s,35個連續(xù)循環(huán);α-SMA反應條件:94℃變性 30 s,57℃退火 30 s,72℃延伸 45 s,28個連續(xù)循環(huán);CollagenI反應條件:94℃變性 30 s,57℃退火 30 s,72℃延伸 45 s,29個連續(xù)循環(huán)。TGF-β1反應條件:94℃變性30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸 45 s,35個連續(xù)循環(huán)。VEGF反應條件:94℃變性 30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸 45 s,40個連續(xù)循環(huán)。得出 Ct值按公式 2-Ct求出基因表達的相對變化量[7],然后進行各組間比較。

1.4 Western blot法檢測 E-cadherin、α-SMA蛋白的表達

裂解處理后的大鼠腹膜間皮細胞,4℃ 1 000 r/min離心 10 min后取裂解液上清測蛋白濃度,取細胞裂解蛋白(約 30μg)經(jīng) SDS-PAGE凝膠電泳后電轉移至 PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉 2 h,分別加入小鼠抗 E-cadherin抗體(美國 BD公司)、小鼠抗 α-SMA抗體(丹麥 Dako公司)和小鼠抗 β-actin抗體(美國 CST公司)4℃過夜,洗膜后加辣根過氧化酶標記的大鼠抗小鼠 IgG抗體(美國 CST公司),37℃、1.5 h,洗膜后加 ECL試劑,X線自顯影顯示結果,分析光帶的吸光度。

1.5 ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中 TGF-β1和VEGF

大鼠腹膜間皮細胞分組干預48 h和72 h后,離心收集細胞上清液,按 ELISA試劑盒說明檢測TGF-β1和 VEGF蛋白水平。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結 果

2.1 原代大鼠腹膜間皮細胞鑒定

腹膜間皮細胞呈圓形、橢圓形、多邊形等,融合后呈典型的鋪路石樣。免疫組化結果示細胞角蛋白(cytokeratin)、波形蛋白(vimentin)陽性。

2.2 AGEs刺激大鼠腹膜間皮細胞引起細胞形態(tài)學變化

正常大鼠腹膜間皮細胞呈鋪路石狀,在AGEs作用 48 h后大鼠腹膜間皮細胞失去原來的整齊排列,細胞逐漸拉長,作用 72 h后細胞出現(xiàn)明顯的梭形或不規(guī)則形改變,似成纖維細胞,部分細胞出現(xiàn)互相交叉重疊現(xiàn)象。

2.3 AGEs對大鼠腹膜間皮細胞 E-cadherin、α-SMA、Collagen I、TGF-β、VEGF mRNA表達的影響

實時定量 PCR檢測結果顯示,AGEs(40 mmol/L、80 mmol/L)刺激 48、72 h后, α-SMA、Collagen I、TGF-β、VEGF mRNA表達水平隨時間延長逐漸增加(圖 1-4),而 E-cadherin mRNA表達水平隨時間延長逐漸下降(圖 5)。與對照組及 BSA組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 各組間皮細胞 α-SMA mRNA的相對表達量

圖2 各組間皮細胞 Collagen I m RNA的相對表達量

圖3 各組間皮細胞 TGF-β1 mRNA的相對表達量

圖4 各組間皮細胞 VEGF m RNA的相對表達量

圖5 各組間皮細胞 E-cadherin m RNA的相對表達量

2.4 AGEs對大鼠腹膜間皮細胞 E-cadherin、α-SMA、TGF-β、VEGF蛋白表達的影響

Western blot結果顯示,AGEs(40 mmol/L、80 mmol/L)刺激 48、72 h后,α-SMA蛋白表達水平隨時間延長逐漸增加(圖 6),而 E-cadherin蛋白表達水平隨時間延長逐漸下降(圖 7)。與對照組及BSA組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

ELISA結果顯示,AGEs(40 mmol/L、80 mmol/L)刺激 48、72 h后,TGF-β、VEGF蛋白表達水平隨時間延長逐漸增加(圖 8-9),與對照組及BSA組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖6 各組間皮細胞 α-SMA蛋白的相對表達量

圖7 各組間皮細胞 E-cadherin蛋白的相對表達量

圖8 各組間皮細胞 TGF-β1蛋白的表達水平

圖9 各組間皮細胞 VEGF蛋白的表達水平

3 討 論

腹膜透析(peritoneal dialysis)已進入臨床 30余年,隨著其裝置的不斷改進,在我國越來越多慢性腎衰患者開始腎替代治療時首選腹膜透析療法。然而隨著腹膜透析時間延長,由于反復發(fā)作的腹膜炎、機體的炎癥狀態(tài)以及非生理性透析液尤其是高濃度葡萄糖、葡萄糖降解產物、AGEs等可引起腹膜結構改變和腹膜功能衰竭,臨床上出現(xiàn)超濾失敗[8]。這是患者退出腹膜透析的主要原因之一,同時也制約了腹膜透析的應用和發(fā)展[9]。長期腹膜透析患者腹膜出現(xiàn)表層間皮細胞消失、大量新生血管形成及透明樣血管病變、纖維化等病理改變,腹膜纖維化和大量新生血管形成是導致腹膜功能衰竭的主要原因。但目前對于導致腹膜纖維化和新生血管形成的機制尚不完全清楚。因此探討腹膜纖維化和新生血管形成的機制,并尋求有效的防治方法,具有重要的臨床意義。正常人的腹膜或非腹膜透析腎衰竭患者的腹膜中并不存在肌成纖維細胞[10]。近年來,越來越多的證據(jù)表明[2,10],腹膜透析患者腹膜組織中肌纖維母細胞明顯增多,肌成纖維細胞的特性是具有合成細胞外基質、細胞因子、生長因子及參與炎癥反應的能力,并具有收縮功能,還可表達平滑肌肌動蛋白,兼有纖維細胞及平滑肌細胞兩者的特性,在各種修復及纖維化過程中,肌成纖維細胞起重要作用。過去認為其主要來源于腹膜組織中活化的成纖維細胞;然而最近的研究發(fā)現(xiàn)[2-4,11-12]:隨著腹膜透析的進行,腹膜透析患者腹膜間皮細胞逐漸喪失上皮細胞表型,同時獲得肌纖維母細胞樣的特性,即發(fā)生 EMT。研究證明 EMT在腎、肝、肺等器官纖維化中有重要的作用[13-15]。因而有學者推測發(fā)生 EMT的腹膜間皮細胞可能是腹膜透析患者腹膜組織中肌纖維母細胞的主要來源之一[4]。但腹膜間皮細胞 EMT在腹膜纖維化和新生血管形成中的作用及機制目前尚不完全清楚。

作者先前的研究表明:高濃度葡萄糖能誘導大鼠腹膜間皮細胞 EMT[16],在本研究中我們探討了 AGEs對大鼠腹膜間皮細胞 EMT的影響。我們體外研究發(fā)現(xiàn):AGEs不僅能引起大鼠腹膜間皮細胞形態(tài)改變(由典型的上皮細胞形態(tài)逐漸變?yōu)樗笮渭安灰?guī)則形,類似肌成纖維細胞),而且晚期糖基化終產物還能上調大鼠腹膜間皮細胞 α-SMA、Collagen I mRNA和 α-SMA蛋白表達水平和下調大鼠腹膜間皮細胞 E-cadherin mRNA和蛋白表達水平,表明 AGEs誘導了大鼠腹膜間皮細胞 EMT;同時我們發(fā)現(xiàn) AGEs能上調大鼠腹膜間皮細胞 TGF-β、VEGF mRNA和蛋白表達水平,而 TGF-β、VEGF在腹膜透析時腹膜纖維化和腹膜新生血管形成過程中起重要作用。我們研究結果為進一步探討腹膜間皮細胞 EMT在腹膜纖維化和新生血管形成中的作用及機制提供了體外模型及實驗基礎。

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