宋增芳,廖月霞,肖煒明,吳克艷,胡 榮,朱海航,趙 梁,卜 平

(揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇揚州,225001)

半枝蓮是一種常見的抗腫瘤中藥,其毒副作用小且有祛邪固本的功效,半枝蓮的水提取物和醇提取物均有明顯的抗肺癌、消化系統(tǒng)癌、乳腺癌、絨膜上皮癌的活性[1-2]。作者的前期實驗研究證明半枝蓮提取物劑量依賴性地抑制腫瘤的生長,同時在一定程度上提高了機體的免疫力。但關(guān)于半枝蓮水煎劑及半枝蓮水提取物的體內(nèi)抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)的作用機制尚未明確。作者就半枝蓮水提取物的體內(nèi)抗腫瘤及其對免疫的雙向調(diào)節(jié)作用進行了初步研究,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材 料

1.1 藥品和試劑

半枝蓮(生):產(chǎn)地江蘇,生產(chǎn)批號901008116,生產(chǎn)許可證號:皖 Y20050032,生產(chǎn)日期:2009年 9月 3日,購于北京同仁堂(亳州)飲片有限責任公司);95%乙醇(揚州市金山化工有限公司);石油醚(分析純)(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);參一膠囊(人參皂甙 Rg3)(吉林省亞泰制藥股份有限公司);VEGF兔抗多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn));S100兔抗多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn));即用型 SABC免疫組化試劑盒 -兔 IgG(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn));DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn))。

1.2 實驗動物及瘤株

BALB/C小鼠 90只,清潔級,體質(zhì)量 18～22 g,雄性,由揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物房提供。S180腹水小鼠:購于江蘇省腫瘤醫(yī)院。

1.3 儀器

SENCOR203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SENCO W201B型恒溫水浴鍋上海申生科技有限公司產(chǎn)品。電熱干燥箱 202-2型,東臺電器廠。電子天平DT500,常熟市百靈天平儀器有限公司。電子天平 MP200A,上海市第二天平儀器廠。

2 方 法

2.1 半枝蓮提取物的制備

本實驗所用的半枝蓮提取物包括半枝蓮水提取物和半枝蓮水煎劑兩種。

半枝蓮水提取物:將半枝蓮全草 6 kg晾干、粉碎,以石油醚在 60℃水浴條件下回流提取 2次,每次 2 h[3]后放入通風櫥中將石油醚揮發(fā)干凈。用水提取,溫度 90℃,時間 3 h,固液比 1:12,提取 3次[4]。合并濾液,將其用離心機以 4 000 r/min離心 18 min,濃縮上清液[5]。向濃縮液中緩慢加入 3倍體積的 95%乙醇,靜置過夜,可見絮狀沉淀析出。4 000 r/min離心 20 min左右,收集沉淀,在70℃烘箱干燥即得到未脫蛋白粗多糖,得率約為 1.29%。

半枝蓮水煎劑的制備:稱取半枝蓮 200 g,加相當于藥材量的 5～7倍的水浸泡 1～2 h,煮沸30 min,過濾,藥渣加水繼續(xù)煎煮 30 min,過濾,合并濾液,于水浴上濃縮成每毫升相當于原生藥材 1 g的半枝蓮水煎劑[6]。

2.2 半枝蓮水提取物對 S180荷瘤小鼠瘤重的影響

2.2.1 建立小鼠模型:將 BALB/C小鼠隨機分為8組,每組 10只。無菌條件下抽取接種 7d的生長良好的 S180荷瘤小鼠腹水(臺盼藍染色顯示活癌細胞數(shù) >95%),用無菌生理鹽水(體積比)1:4稀釋,在小鼠右前腋部皮下接種,每只 0.2 mL,于 30 min內(nèi)接種完成。

2.2.2 給藥:于小鼠接種 24 h后開始給藥,每日1次,共 7 d。Ⅰ組為模型對照組,給予 0.9%生理鹽水,0.1 mL/10 g,灌胃;Ⅱ組參一膠囊(人參皂甙 Rg3)組,劑量為 5.2 mg/kg,0.1 mL/10 g,灌胃;Ⅲ組為空白組(未接種腫瘤),給予 0.9%生理鹽水,0.1 mL/10 g灌胃;Ⅳ組為半枝蓮水煎劑高劑量組,半枝蓮水煎劑的濃度為 0.8 g/L,按0.2 mL/10 g灌胃;Ⅴ組半枝蓮水煎劑中劑量組,按 0.1 mL/10 g灌胃;Ⅵ組為半枝蓮水煎劑低劑量組,按 0.05 mL/10 g灌胃;Ⅶ組為半枝蓮粗水提取物高劑量組,200 mg/(kg·d),配置濃度為0.2 g/10 mL,按 0.1 mL/10 g灌胃;Ⅷ組為半枝蓮水提取物中劑量組,100 mg/(kg·d),配置濃度為 0.1 mL/10 g,按 0.1 mL/10 g灌胃;Ⅸ組為半枝蓮水提取物低劑量組,50 mg/(kg·d),配置濃度為 0.05 g/10 mL,按 0.1 mL/10 g灌胃。將 90只雄性小鼠常規(guī)飼養(yǎng),自由飲水進食,實驗室溫度 22～25℃,相對濕度 60%～70%,并保持良好的光照和通風條件,每天固定時間段記錄小鼠的體重及活動情況[7-8]。給藥 7 d后停藥,停藥后次日處死小鼠,處死小鼠的前夜予以禁食,但不禁水。

2.2.3 測抑瘤率:停藥次日處死,稱取小鼠瘤重[9]。

2.3 半枝蓮水提取物對 S180荷瘤小鼠胸腺、脾臟、肝臟的影響

實驗動物模型制造方法同 2.2,給藥劑量及途徑也相同。末次給藥后 24 h處死,分別稱取體重、胸腺、脾臟及肝臟的重量,按公式計算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)[10]。

胸腺指數(shù)(mg/g)=胸腺重/體重

脾指數(shù)(mg/g)=脾重 /體重

肝指數(shù)(mg/g)=肝重 /體重

2.4 半枝蓮提取物對 S180移植瘤小鼠瘤體中VEGF及 DC的影響

實驗動物模型制造方法及給藥劑量與途徑按2.2進行。給藥 7 d后停藥,停藥后次日處死小鼠,摘取腫瘤組織,固定、包埋、切片后用免疫組化法測定腫瘤組織中 VEGF及 DC的表達情況使用JEDA801D形態(tài)學(xué)圖像系統(tǒng)軟件進行分析。免疫組化染色評分按 Rahman[11]等的方法進行。

3 結(jié) 果

3.1 半枝蓮水提取物對 S180小鼠表現(xiàn)出不同的抑瘤作用

對 S180小鼠瘤重的影響(表 1),半枝蓮提取物對 S180小鼠表現(xiàn)出不同的抑瘤作用。與模型組比較高、中劑量組表現(xiàn)出良好的抑瘤效果,有顯著性差異(P<0.01),低劑量有差異(P<0.05),與陽性對照比較,中劑量組與參一膠囊組比,抑瘤率有明顯升高。

表 1 藥物對 S180移植瘤小鼠瘤重的影響

3.2 半枝蓮水提取物對 S180荷瘤小鼠肝指數(shù)、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響

半枝蓮提取物對 S180荷瘤小鼠肝指數(shù)、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響如表 2所示,與模型組比較半枝蓮提取物中、低劑量組胸腺指數(shù)都有顯著提高,而高劑量組明顯受到抑制,且差異顯著(P<0.05或 <0.01)。各用藥組脾指數(shù)均較模型組有所提高,其中半枝蓮提取物高、中劑量組脾臟指數(shù)均較模型組顯著提高(P<0.05或 <0.01),半枝蓮水煎劑中劑量組脾指數(shù)較參一膠囊陽性對照組有顯著提高(P<0.05)。各用藥組肝指數(shù)均較模型組有所提高,其中半枝蓮提取物高、中劑量組肝臟指數(shù)均較模型組有顯著提高(P<0.05或 <0.01),各用藥組肝指數(shù)與參一膠囊組相比較無差異。

表 2 半枝蓮提取物對 S180荷瘤小鼠肝指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的響

3.3 半枝蓮水提取物對 S180移植瘤小鼠瘤體中VEGF及 DC的影響

VEGF陽性反應(yīng)細胞的胞漿被染成棕黃色,背景呈淺黃色或不著色。每張切片隨機選取 5個視野(放大倍數(shù)為 200),進行免疫組化染色評分。免疫組化染色評分標準是:根據(jù)著色細胞的比例(染色范圍)及染色強度評分,染色范圍(陽性細胞比率)分為 0～4級,陰性為 0分;陽性細胞0～25%為 1分;陽性細胞 26% ～50%為 2分;陽性細胞 51% ～75%為 3分;陽性染色 76% ～100%為 4分。染色強度劃分為 0～3級;陰性為0分;弱陽性為 1分;中等強度為 2分;強陽性為 3分,兩者得分相加為最后評分。模型組陽性率最高,以半枝蓮水煎劑中劑量組的陽性率最低。

S100蛋白位于細胞的胞漿及胞核中,S100陽性細胞的胞漿染成棕黃色,胞核也可見著色,我們將細胞形態(tài)可辨且不規(guī)則,胞漿胞核均染色的細胞才計數(shù)為 S100陽性的樹突狀細胞。每張切片隨機選取 5個視野(放大倍數(shù)為 400),觀察并計數(shù)樹突細胞,計算每個高倍視野的樹突狀細胞平均數(shù)。模型組未見有陽性細胞浸潤,以半枝蓮水煎劑中劑量組的陽性率最高。

實驗結(jié)果顯示(表 3),半枝蓮水提取物給藥劑量不同,VEGF在小鼠 S180肉瘤組織內(nèi)表達有區(qū)別,半枝蓮各用藥組 VEGF表達評分均較模型組有所下降,半枝蓮水煎劑三個劑量組及半枝蓮水提取物中、低劑量組均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);并且半枝蓮水煎劑高、中劑量及半枝蓮水提取中劑量組對小鼠 S180肉瘤組織內(nèi)VEGF表達的抑制程度較陽性藥物人參皂甙 Rg3更為強大。半枝蓮水提取高劑量組與模型組比較無差異。

模型組未見有 S100陽性樹突狀細胞細胞的浸潤,而各用藥組則見不同程度的浸潤,其中以半枝蓮水提取物高、中劑量組的浸潤密度最為突出,具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

由表 3中數(shù)據(jù)可以看出,各用藥組 VEGF表達的評分越低,樹突狀細胞的浸潤密度則相對越高。故而將各組的 VEGF表達與樹突狀細胞浸潤密度進行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示(圖 1):VEGF表達與DC浸潤密度之間呈顯著性負相關(guān)(r=-0.595,P<0.01)。

表 3 VEGF和 S100在小鼠瘤體中表達情況

圖1 VEGF表達與 DC浸潤密度的相關(guān)性分析

4 討 論

研究表明,VEGF一方面能促進腫瘤的血管生成,另一方面 VEGF是 DC生成和成熟的重要負調(diào)控因子,VEGF能抑制DC的分化及 imDC的功能性成熟,VEGF抑制 mDC行使功能,從而抑制機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答,使腫瘤細胞逃避機體的免疫監(jiān)視[12]。而 DC能夠介導(dǎo) VEGF生成。兩者相互影響,形成惡性循環(huán),導(dǎo)致腫瘤進展、惡化、轉(zhuǎn)移?？闪13]通過實驗證明半枝蓮多糖可上調(diào)H-22小鼠血清中 IL-2、IL-12、TNF-a的表達、下調(diào) VEGF的表達。作者認為半枝蓮提取物或許通過在體內(nèi)下調(diào) VEGF及上調(diào) DC的雙向調(diào)節(jié),進而增強機體的抗腫瘤免疫。

中藥作為免疫調(diào)節(jié)和促進劑,在提高機體免疫功能、抗腫瘤方面起著越來越重要的作用,在腫瘤臨床治療上有著廣闊的應(yīng)用。隨著現(xiàn)代腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展,已經(jīng)認識到 DC的數(shù)量及功能正常與否是機體抗腫瘤免疫應(yīng)答的重要條件,因此 DC可能是中藥影響免疫功能的關(guān)鍵所在。DC可以合成和分泌 S100蛋白,目前許多文獻報道 S100蛋白標記了包括成熟的以及不成熟的所有樹突狀細胞[14]。S100陽性樹突狀細胞在抗腫瘤免疫中被認為是先趨向于被機體視為異物的腫瘤周圍[15],再逐漸移入腫瘤細胞之間,通過它的樹突與腫瘤細胞密切接觸后獲得抗原,再移行到局部淋巴結(jié),將腫瘤抗原呈遞給 T細胞,發(fā)揮 T細胞的細胞毒作用而殺傷破壞腫瘤細胞,形成免疫監(jiān)視。通過腫瘤組織內(nèi) S100的表達情況可以了解樹突狀細胞的浸潤情況,從而間接了解腫瘤的免疫微環(huán)境狀況。

在實驗中,作者發(fā)現(xiàn)還隨著半枝蓮水提取物給藥濃度的變化,VEGF在小鼠 S180肉瘤組織內(nèi)的表達越強,DC的浸潤密度卻越小,而且 VEGF表達與 S100陽性 DC浸潤密度之間呈顯著性負相關(guān),VEGF表達的評分越高,樹突狀細胞的浸潤密度則相對越低。學(xué)者們通過大量實驗推斷,腫瘤分泌的 VEGF通過抑制 HPC中 NF-κB活化,進而降低核內(nèi) h10組蛋白基因的表達,從而影響HPC分化成為成熟 DC。Mimura等[16]通過體外誘導(dǎo)實驗發(fā)現(xiàn),VEGF劑量依賴性地抑制 mDC激活同種異體 T細胞的能力。而且 VEGF誘導(dǎo)的mDC功能障礙主要由 VEGFR2所介導(dǎo)。Webster等發(fā)現(xiàn) DC能激發(fā)淋巴結(jié)內(nèi)皮細胞增殖和血管生長,同時伴隨淋巴結(jié)內(nèi) VEGF水平升高,Lu等[17]在沒有淋巴細胞的小鼠體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)存在這種現(xiàn)象。張義[18]通過實驗表明在肝細胞肝癌組織中VEGF表達和 DC浸潤程度呈負相關(guān),VEGF表達增加可抑制 DC在肝癌組織中浸潤;腫瘤直徑越大 VEGF表達越高;DC浸潤程度與腫瘤直徑負相關(guān)。鄭海燕等[19]采用免疫組化 SP法檢測 20例胃炎組織及 50例胃癌組織中的 DC和 VEGF。結(jié)果表明胃癌組織中 DC與 VEGF的表達呈負相關(guān),胃癌組織中 DC數(shù)減少、VEGF表達增多,二者相互作用,促進胃癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。因此,作者推測 VEGF是通過抑制 DC的分化及功能性成熟,從而導(dǎo)致 DC數(shù)量的減少。

本組實驗結(jié)果表明,半枝蓮水提取物具有顯著的抗腫瘤作用,并能夠提高荷瘤小鼠免疫器官的重量,其抗腫瘤機理可能是通過增強機體的免疫力達到抗腫瘤的效果。半枝蓮提取物能顯著抑制腫瘤組織中 VEGF的表達,抑制其介導(dǎo)的腫瘤血管生成而達到良好的抑瘤效果;各用藥組瘤組織中的 DC的表達都有一定程度上的提高,且 DC的表達與 VEGF呈負相關(guān)。VEGF是 DC的負調(diào)控因子,所以試驗中 DC表達水平的提高是半枝蓮提取物的直接作用還是間接作用尚不明確,需要進一步深入的研究。

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