司梁宏，陶 震，劉 靜，劉 梅，邱 彥 （解放軍454醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京 210002）

十味板藍(lán)根顆粒是我院臨床常用的自制中藥制劑（南制字（2006）F54007號），由板藍(lán)根、大青葉、金銀花、連翹等十味中藥材組成，主要用于感冒引起的發(fā)熱、惡寒、頭痛、流涕、咽痛等癥。其方中君藥板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)（Isatis indigoticaFort.）的干燥根，性寒味苦，具有清熱解毒、涼血利咽的功效，臨床上廣泛用于治療流感、病毒性肝炎、帶狀皰疹、腮腺炎等病毒感染性疾病。作為一種重要的抗病毒藥物，板藍(lán)根對多種病毒具有抑制感染及增殖的作用[1-4]。十味板藍(lán)根顆粒所含其他主藥均為清熱解毒中藥，研究其抗病毒作用可為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

十味板藍(lán)根顆粒（解放軍454醫(yī)院藥劑科自制，規(guī)格：15 g/袋，批號 20080331）；陽性對照藥：利巴韋林注射液（上海信誼金朱藥業(yè)有限公司，1 mL∶100 mg，批號 080951）。

胰蛋白酶（Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基，MEM培養(yǎng)基（HyClone公司）；胎牛血清（杭州四季青有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的DMEM；細(xì)胞維持液為含有2%胎牛血清的DMEM；常規(guī)加入100 u·mL-1的青霉素、鏈霉素（Sigma公司）。

1.2 細(xì)胞株與病毒株

Hep-2細(xì)胞株和Hela細(xì)胞株均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所?？滤_奇病毒B3株（CVB3）和單純皰疹病毒Ⅱ型（HSV-Ⅱ）均購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所。

1.3 實驗儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國Forma Scien-tific公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；超凈工作臺（上海值歐凈化設(shè)備有限公司）；DL-360A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)。

2 方法

2.1 溶液的制備

將十味板藍(lán)根顆粒溶于維持液中，滅菌后配成濃度為100 mg·mL-1的溶液，按比例依次稀釋成4000，2000，1000，500，250，125，63和31 μg·mL-1的溶液；利巴韋林注射液用維持液稀釋至濃度分別為1000，500，250，125，63和31 μg·mL-1的溶液；溶劑對照組不加藥物，加入細(xì)胞維持液。

2.2 病毒毒力測定

以細(xì)胞病變效應(yīng)法（CPE法）測定50%組織細(xì)胞感染劑量（TCID50）。細(xì)胞病變率達(dá)50%及以上的培養(yǎng)孔為病變孔，細(xì)胞病變率小于50%者為非病變孔，根據(jù)Reed-Muench法計算病毒的TCID50[5]。

2.2.1 CVB3病毒毒力測定 常規(guī)方法培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞，將對數(shù)生長期的Hep-2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，制成5×104個·mL-1的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，置5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿單層后,每孔接種MEM培養(yǎng)基稀釋的不同濃度（10-1～10-8）的CVB3病毒液。每個濃度接種8個孔，每孔0.1 mL，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。于37 ℃吸附2 h后棄上清，加入細(xì)胞維持液連續(xù)培養(yǎng)96 h，每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變程度（CPE），測定其TCID50。

2.2.2 HSV-Ⅱ病毒毒力測定 常規(guī)方法培養(yǎng)Hela細(xì)胞，將對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，制成5×104個·mL-1的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，置5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿單層后,每孔接種MEM培養(yǎng)基稀釋的不同濃度（10-1～10-8）的HSV-Ⅱ病毒液。設(shè)復(fù)孔、對照及測定方法同“2.2.1”項。

2.3 藥物的細(xì)胞毒性測定

將對數(shù)生長期的Hep-2細(xì)胞和Hela細(xì)胞消化計數(shù)后，接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞長滿單層后,分別加入8個不同濃度的十味板藍(lán)根顆粒溶液（4000，2000，1000，500，250，125，63和31 μg·mL-1）和利巴韋林6個不同濃度的的藥物溶液（1000，500，250，125，63和31 μg·mL-1），每個濃度4個孔，每孔0.15 mL，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)96 h，每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況，測定藥物的最大無毒濃度（TD0）[6-7]。

2.4 十味板藍(lán)根顆粒劑的抗病毒實驗

參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]進(jìn)行實驗。待96孔培養(yǎng)板Hep-2細(xì)胞長滿單層后，每孔以100 TCID50的CVB3感染Hep-2細(xì)胞；在另一96孔培養(yǎng)板的Hela單層細(xì)胞內(nèi)，每孔以100 TCID50的HSV-Ⅱ感染Hela細(xì)胞；于37 ℃吸附2 h后均棄去病毒液，分別加入6個不同濃度（1000，500，250，125，63和31 μg·mL-1）的十味板藍(lán)根溶液和利巴韋林藥液，每個濃度4個孔，同時均設(shè)溶劑對照、病毒對照及正常細(xì)胞對照，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)96 h，每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，記錄病變情況。當(dāng)病毒對照達(dá)到“++++”時，判定結(jié)果，如果細(xì)胞對照生長良好，加入藥物的細(xì)胞出現(xiàn)“+++”以上病變時，可判定該濃度的藥物無抗病毒的作用。

3 結(jié)果

3.1 病毒毒力測定結(jié)果

以CVB3和HSV-Ⅱ的不同濃度（10-1～10-8）稀釋病毒液分別接種培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變CPE（50%以上明顯病變?yōu)榧?xì)胞病變孔），計算CVB3病毒的TCID50為10-6.5，HSV-Ⅱ病毒的TCID50為10-5.7。

3.2 藥物的細(xì)胞毒性測定結(jié)果

十味板藍(lán)根顆粒劑對Hep-2細(xì)胞和Hela細(xì)胞毒性均較低，最大無毒濃度均為1 mg·mL-1；而利巴韋林在所設(shè)試驗濃度下未觀察到細(xì)胞毒性反應(yīng)。細(xì)胞毒性鏡檢結(jié)果見表1。

表 1 十味板藍(lán)根顆粒劑的細(xì)胞毒性結(jié)果Tab 1 Cytotoxicity effect of the compound radix isatidis granules to cells

3.3 十味板藍(lán)根顆粒劑的抗病毒實驗

實驗結(jié)果表明：各濃度藥物對CVB3和HSV-Ⅱ病毒均有一定的抑制作用，藥物濃度在250、125和63μg·mL-1時，十味板藍(lán)根顆粒劑對病毒致細(xì)胞病變可產(chǎn)生不同程度的抑制作用，但均不如利巴韋林。利巴韋林濃度500 μg·mL-1時可以完全抑制病毒所致細(xì)胞病變。十味板藍(lán)根顆粒劑濃度在500 μg·mL-1以上時，可以明顯抑制CVB3病毒對Hep-2細(xì)胞的致病變作用，抑制HSV-Ⅱ病毒對Hela細(xì)胞的感染致病變作用，對Hep-2和Hela細(xì)胞有保護(hù)作用，并且隨著藥物濃度的增加，CPE特征逐漸減弱，病毒抑制率（細(xì)胞存活率）明顯升高。鏡檢結(jié)果分別見表2、表3。

表 2 十味板藍(lán)根顆劑抗CVB3病毒感染Hep-2細(xì)胞的作用Tab 2 Antiviral activity effect of the compound radix isatidis granules to CVB3 in vitro

表 3 十味板藍(lán)根顆粒劑抗HSV-Ⅱ病毒感染Hela細(xì)胞的作用Tab 3 Antiviral activity effect of the compound radix isatidis granules to HSV-Ⅱ in vitro

4 討論

HSV-Ⅱ和CVB3均是引起呼吸系統(tǒng)感染的重要病原，可在嬰幼兒和老年以及免疫缺陷人群引起嚴(yán)重肺炎，甚至危及生命?，F(xiàn)有的病毒性疾病治療藥物主要是化學(xué)合成類，容易產(chǎn)生藥品不良反應(yīng)和耐藥性。常用的抗病毒藥物利巴韋林可以有效抑制CVB3等病毒復(fù)制，但其屬于核苷類似物，毒性較大，而且還有致畸作用[8]。

十味板藍(lán)根顆粒是由十味中藥配伍而成的復(fù)方制劑，通過多種有效成分、多環(huán)節(jié)、多途徑地發(fā)揮協(xié)同作用而表現(xiàn)出抗病毒功效，其抗病毒作用是多種化學(xué)成分和機(jī)制綜合作用的結(jié)果，可能是總生物堿的直接抑制病毒作用、多糖成分的促進(jìn)免疫和抗體生成作用、醇提部位的抗炎和縮短病程作用、有機(jī)酸部位的抗菌和抗內(nèi)毒素作用等[9]。

本實驗采用病毒體外感染細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，十味板藍(lán)根顆粒劑濃度在500 μg·mL-1時可明顯抑制病毒感染致細(xì)胞病變作用，當(dāng)濃度分別達(dá)到125μg·mL-1和250 μg·mL-1時,十味板藍(lán)根顆粒劑顯示出抗HSV-Ⅱ病毒感染Hela細(xì)胞和抗CVB3病毒感染Hep-2細(xì)胞的作用,提示十味板藍(lán)根顆粒用于感冒的療效基礎(chǔ)可能與其抗病毒活性緊密相關(guān)。實驗結(jié)果也表明，十味板藍(lán)根顆粒劑的抗病毒整體效果不如利巴韋林好。但藥理實驗與臨床已證實，十味板藍(lán)根顆粒具有清熱解毒利咽、抗菌抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛及抗炎的功效；動物體內(nèi)實驗也證明，十味板藍(lán)根顆粒能顯著降低啤酒酵母所致的大鼠直腸溫度升高，并能顯著減少醋酸所致小鼠腹痛的扭體次數(shù)，同時顯著延長小鼠熱板的痛閾時間，具有顯著的解熱和鎮(zhèn)痛作用[10]；對角叉菜膠及二甲苯所致腫脹有明顯的抑制作用，能顯著的抑制醋酸所致小鼠腹腔內(nèi)炎性物質(zhì)的滲出，對急性和慢性炎癥均有明顯的抑制作用[11]。

建議臨床上考慮采用利巴韋林與十味板藍(lán)根顆粒劑聯(lián)合治療上呼吸道感染，既能發(fā)揮利巴韋林抑制核糖核酸而達(dá)到廣譜抗病毒作用，又能體現(xiàn)十味板藍(lán)根顆粒劑清熱解毒、涼血利咽、疏風(fēng)解表的功效，具體的臨床療效、毒副作用及不良反應(yīng)等情況，還有待于臨床上進(jìn)一步觀察。

志謝：本研究中的抗病毒實驗由南方醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)系徐江平教授課題組協(xié)助完成，特此表示感謝！

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