廖 燕 林書瀚 黎丹戎 利基林 唐東平 唐 凱 張力圖

SLC30A9(solute carrier family 30 member 9)又名GAC63，是一個(gè)與DNA修復(fù)相關(guān)的基因［1］，其大部分功能未知。SLC30A9定位于4p13，在以往的研究中，大約50%膀胱癌被證實(shí)在4p13的4個(gè)區(qū)域存在雜合性缺失［2］，在其它的人類腫瘤包括子宮頸癌［3］、胃腺癌［4］和 BRCA1突變的腫瘤中［5］，通過掃描腫瘤組織染色體區(qū)域發(fā)現(xiàn)，4號(hào)染色體短臂存在頻繁的雜合性缺失，提示該區(qū)域的基因可能與腫瘤的發(fā)病有關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)，SLC30A9可以與β-catenin相互作用，影響Wnt信號(hào)通路的激活［6］，而Wnt信號(hào)通路與多種腫瘤的發(fā)展相關(guān)［7］。我們從生物信息學(xué)分析得到SLC30A9在乳腺癌組織和正常乳腺組織中存在差異性表達(dá)，因此，本研究以RT-PCR技術(shù)探討SLC30A9在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步分析SLC30A9與腫瘤發(fā)生的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與標(biāo)本保存

30例乳腺癌標(biāo)本取自2004年12月至2005年6月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院住院的手術(shù)病例?；颊呔鶠榕?，年齡30～74歲，中位47歲。其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌25例，低分化腺癌2例，乳頭狀癌1例，黏液腺癌1例，導(dǎo)管內(nèi)癌1例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例。所有病例均經(jīng)病理檢查確診，分別收集30例乳腺癌癌灶組織、30例癌旁組織和10例相應(yīng)的正常乳腺黏膜組織(距離病灶5cm以上且無癌浸潤(rùn)者)。期間還收集了20例乳腺良性病變組織。這些組織分別離體后，10min內(nèi)投入液氮速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

Trizol總RNA抽提試劑由Invitrogen公司提供，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Taq酶、RNAse-free水等試劑由Promega公司提供。引物設(shè)計(jì)采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)，引物合成由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。儀器主要為美國(guó)PTC2000型多通道PCR儀、美國(guó)PE公司PX2型高性能PCR儀，美國(guó)Bio-Rad Gel DOC2000型凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.3 RNA的提取

1.3.1 物品和試劑的特殊準(zhǔn)備:將清潔的金屬器械和泡酸晾干的玻璃器皿放入烤箱，180℃以上高溫烘烤5h，以滅活RNA酶，不耐高溫的塑料和橡膠制品用配好的1‰DEPC液浸泡12h以上，撈起裝盒、打包，高壓蒸汽滅菌后烘干備用。所用的溶液均用RNAsefree DEPC水配制。

1.3.2 抽提總RNA的步驟 利用TROZOL一步法提取。

1.3.3 總RNA的鑒定 測(cè)定RNA的濃度和純度:取5μl RNA液加入195μl Rnase-free DEPC水稀釋40倍，用雙光束紫外分光光度儀(超薄石英杯)測(cè)定λ260nm和λ280nm的吸光度值(OD值)，根據(jù)公式計(jì)算濃度CRNA(μg/ml)=OD260×40×40÷1 000，根據(jù)OD260/OD280比值反映RNA純度，所有樣本的OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間，說明提出的RNA純度較高，符合標(biāo)準(zhǔn)。

總RNA的電泳鑒定:用1%瓊脂糖凝膠電泳1h，瓊脂糖凝膠用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，觀察若有28S、18S兩條帶出現(xiàn)，5S條帶很微弱，加樣孔內(nèi)無明顯DNA殘留，說明所提取的總RNA符合要求。

1.3.4 逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 按照A3500型逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)實(shí)驗(yàn)操作步驟進(jìn)行。在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄前先去除RNA中可能存在的痕量DNA。

1.3.5 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 所用引物為:F-5'GCC AAT TGC ATG GGC CTT AGT TC 3'R-5'TGC CCT TAC TGA TCG GTC ATT CTC C 3'10μl反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為94℃變性30s、65℃復(fù)性30s、72℃延長(zhǎng)1min，30次循環(huán)。

1.3.6 RT-PCR結(jié)果判定 1.6%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，凝膠電泳成像系統(tǒng)成像，測(cè)算出相應(yīng)的光密度比值(SLC30A9 mRNA與GAPDH mRNA之比)。凝膠電泳分析軟件(BIORAD公司Quantity one軟件)分析測(cè)定其光密度，各電泳條帶凈密度值按下列公式計(jì)算:凈密度值=(平均密度-背景密度)×面積。以所擴(kuò)GAPDH密度作為內(nèi)參照，以目標(biāo)基因凈密度與GADPH凈密度的比值進(jìn)行半定量比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS10.0 for windows軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)、計(jì)量資料分別做t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLC30A9 mRNA的表達(dá)水平

全組90例乳腺組織樣品中均有SLC30A9 mRNA表達(dá)。在30例乳腺癌患者中，5例(4、9、10、12號(hào)和13號(hào))患者的癌組織、癌旁組織及正常組織中均存在SLC30A9基因mRNA差異性表達(dá)，占16.7%(5/30)。4、9號(hào)和12號(hào)患者的癌組織中，SLC30A9的表達(dá)比相應(yīng)的正常組織低，而10號(hào)和13號(hào)患者則表現(xiàn)出在癌組織中表達(dá)上調(diào)。SLC30A9 mRNA在乳腺癌組織、癌旁組織、正常乳腺組織和乳腺良性病變組織的表達(dá)情況。見圖1-3。

圖3 乳腺癌(T)、乳腺良性病變組織(B)SLC30A9基因mRNA表達(dá)的瓊脂糖電泳圖

從組間分析來看，SLC30A9基因mRNA在30例乳腺癌患者的癌組織、癌旁組織和10例正常乳腺組織及20例乳腺良性病變組織中均有表達(dá)。其平均光密度比值分別為0.443±0.247、0.427±0.253、0.405±0.209、0.547±0.190。上述4組分別兩兩比較，SLC30A9 mRNA表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 乳腺癌組織、癌旁組織和正常乳腺組織SLC30A9 mRNA表達(dá)水平比較)

表1 乳腺癌組織、癌旁組織和正常乳腺組織SLC30A9 mRNA表達(dá)水平比較)

組織類型 n SLC30A9 mRNA P乳腺癌組織 30 0.443±0.247乳腺癌癌旁組織 30 0.427±0.253正常乳腺組織 10 0.405±0.209乳腺良性病變組織 20 0.547±0.190＞0.05

2.2 乳腺癌組織SLC30A9 mRNA的表達(dá)與各臨床病理因素的關(guān)系

乳腺癌組織中SLC30A9 mRNA的平均光密度比值在不同年齡、臨床分期、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 SLC30A9 mRNA在癌組織中的表達(dá)與各臨床病理因素的關(guān)系

3 討論

本研究利用半定量RT-PCR法對(duì)30例乳腺癌的癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織、10例正常乳腺組織和20例乳腺良性病變組織進(jìn)行SLC30A9 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLC30A9基因mRNA在90例乳腺組織樣品中均有表達(dá)。對(duì)其平均光密度值進(jìn)行比較，組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。即從整體組間的比較來看，沒有差異性表達(dá)，提示SLC30A9對(duì)乳腺癌的發(fā)生不是一個(gè)主要的因素。但研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生是多個(gè)基因相互作用的過程，大多數(shù)涉及的基因只起著部分作用。在突變掃描的研究中，往往只在大量的目的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)極少部分的突變。因此，在篩選疾病基因的過程中我們更應(yīng)注重個(gè)體的差異。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)5例標(biāo)本在癌組織、癌旁組織及正常組織中存在表達(dá)異常，占16.7%(5/30)，其中，有3例癌組織SLC30A9的表達(dá)比相應(yīng)的正常乳腺組織低，而其他2例則表現(xiàn)出在癌組織中表達(dá)上調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在這些標(biāo)本中存在有基因突變的可能，這有待于突變掃描的結(jié)果證實(shí)。也可能該基因的表達(dá)調(diào)控出現(xiàn)誤差，造成表達(dá)的不穩(wěn)定。提示SLC30A9基因可能不是乳腺癌主導(dǎo)基因，但有可能起部分作用或與其他因素共同作用。

將30例乳腺癌患者按不同年齡(是否≥45歲)、臨床分期的早晚(Ⅰ/Ⅱ期或Ⅲ/Ⅳ期)、病理類型(浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、黏液腺癌、低分化腺癌、乳頭狀癌、導(dǎo)管內(nèi)癌)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組后，分別在不同組別間比較癌組織SLC30A9 mRNA表達(dá)水平，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示SLC30A9 mRNA與乳腺癌患者不同年齡、臨床分期、病理類型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等無關(guān)。

由于我們發(fā)現(xiàn)在一些標(biāo)本中SLC30A9的表達(dá)有上調(diào)，而一些標(biāo)本中有下調(diào)，因此我們用生物信息學(xué)的方法分析基因的microRNA(miRNA)調(diào)控情況，發(fā)現(xiàn)在SLC30A9的3'端非翻譯區(qū)存在有miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，這說明該基因可能受mRNA的調(diào)控。這提示我們需要做該基因的miRNA結(jié)合位點(diǎn)的掃描分析，觀察是否存在基因突變從而影響表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)，大約有30%的人類基因表達(dá)可以被miRNA調(diào)控，而miRNA的調(diào)控與腫瘤的發(fā)生相關(guān)［8～10］。有關(guān)方面值得深入研究。

［1］ 張忠清.2001年美國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告介紹［J］.中國(guó)腫瘤，2001，10(9)∶520-522.

［2］ Walker RA，Jones JL，Chappell SA，et al.Molecular pathology of breast cancer and its applocation to clinical management［J］.Cancer and Metastasis Reviews，1997，16(1)∶5-27.

［3］ Strausberg RL，F(xiàn)eingold EA，Grouse LH，et al.Generation and initial analysis of more than 15 000 full-length human and mouse cDNA sequences［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(26)∶16899-16903.

［4］ Sim DL，Chow VT.The novel human HUEL(C4orf1)gene maps to chromosome 4p12～p13 and encodes a nuclear protein containing the nuclear receptor interaction motif［J］.Genomics，1999，59∶224-233.

［5］ Sim DL，Yeo WM，Chow VT.The novel human HUEL(C4orf1)protein shares homology with the DNA-binding domain of the XPA DNA repair protein and displays nuclear translocation in a cell cycle-dependent manner［J］.The International Journal of Biochemistry ＆ Cell Biology，2002，34∶487-504.

［6］ Chen YH，Yang CK，Xia M，et al.Role of GAC63 in transcriptional activation mediated by beta-catenin［J］.Nucleic Acids Res，2007，35(6)∶2084-2092.

［7］ 杜彥艷，劉 鑫，單保恩.Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.腫瘤，2009，29(8)∶803-805.

［8］ Denli AM，Tops BB，Plasterk RH，et al.Processing of primary microRNAs by the microprocessor complex［J］.Nature，2004，432∶231-235.

［9］ Gregory RI，Yan KP，Amuthan G，et al.The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs［J］.Nature，2004，432∶235-240.

［10］ Lund E，Guttinger S，Calado A，et al.Nuclear export of microRNA precursors［J］.Science，2004，303∶95-98.