張小翠，賀紅焰，夏紀(jì)毅，樊均明，歐三桃，劉 建△

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1腎病內(nèi)科，2病理教研室，3分子與免疫研究室，四川 瀘州 646000)

腎素－血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)在腎臟纖維化過程中發(fā)揮著重要作用。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)作為RAS的主要成員，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，血管收縮，細(xì)胞增殖，纖溶減弱，醛固酮分泌增加，造成高血壓及心、腦、腎等一系列靶器官的損害。腎臟局部的AngⅡ在腎病進(jìn)展中也起著重要作用。已有研究證實(shí)AngⅡ能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞，參與腎間質(zhì)纖維化的形成［1，2］。血管緊張素 －(1－7)［Ang－(1－7)］是近年來發(fā)現(xiàn)的具有多種生物學(xué)活性的RAS新成員，被認(rèn)為是AngⅡ的內(nèi)源性拮抗因子，具有擴(kuò)張血管，降低血壓，利尿、利鈉，調(diào)節(jié)水、鹽、電解質(zhì)平衡，以及抗增殖作用［3，4］。目前，對(duì)于在病理情況下，Ang－ (1 －7)是否能通過抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化，減少細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的生成，從而減少腎小管間質(zhì)區(qū)域ECM積聚，尚無直接證據(jù)。本研究將體外培養(yǎng)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，以AngⅡ作為刺激因子，探索Ang－(1－7)在腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化過程中的作用及可能機(jī)理，為治療腎臟纖維化，阻止慢性腎臟疾病的進(jìn)行性發(fā)展提供新的治療思路。

材料和方法

1 材料

大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞株(NRK－49F)由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng);Ang－(1－7)、AngⅡ和抗α－平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha－smooth muscle actin，α －SMA)購(gòu)自 Sigma;抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 －β1(transforming growth factor－β1，TGF－β1)抗胰島素樣生長(zhǎng)因子－I(insulin like growth factor I，IGF－I)購(gòu)自北京博奧森公司;Ⅰ型膠原 (collagen typeⅠ，ColⅠ)、TGF－β1和IGF－I檢測(cè)ELISA試劑盒購(gòu)自R＆D;免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。

2 方法

2.1 NRK－49F的培養(yǎng) 復(fù)蘇細(xì)胞后將其加入DMEM/F12培養(yǎng)基并接種于培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱。細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)為長(zhǎng)梭形。至細(xì)胞長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)，用2.5%胰蛋白酶消化，傳代，取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將培養(yǎng)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞制成1×108/L的細(xì)胞懸液，接種在6孔板中1 cm×1 cm的蓋玻片上，每孔加入細(xì)胞懸液2 mL，無血清DMEM培養(yǎng)24 h，使其生長(zhǎng)同步化。按下列分組加入不同干擾因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(1)對(duì)照組:僅加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基;(2)AngⅡ組:加入含AngⅡ終濃度為10－6mol/L的DMEM/F12培養(yǎng)基;(3)Ang－(1－7)組:加入含 Ang－(1－7)終濃度為10－5mol/L的DMEM/F12培養(yǎng)基;(4)Ang－(1－7)+AngⅡ組:同時(shí)加入含AngⅡ終濃度為10－6mol/L和Ang－(1－7)終濃度均為10－5mol/L的DMEM/F12培養(yǎng)基。

2.3 細(xì)胞免疫化學(xué)法(SP法)測(cè) α －SMA、TGF－β1、IGF－Ⅰ的表達(dá) 按上述分組加入不同藥物干預(yù)72 h后，取出6孔板中細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%Triton X－100處理細(xì)胞30 min，3%H2O2孵育10 min。分別加入小鼠抗大鼠α－SMA單抗(1∶50)、兔抗大鼠 TGF－β1多抗(1∶50)和兔抗大鼠IGF－I多抗(1∶50)，4℃冰箱過夜。接下來按免疫組織化學(xué)染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，倒置熒光顯微鏡觀察陽性信號(hào)，并照像以備數(shù)據(jù)分析。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè) ColⅠ、TGF－β1和IGF－Ⅰ的表達(dá) 按上述分組加入不同藥物干預(yù)72 h后，吸取培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，于波長(zhǎng)450 nm的全光譜分光光度計(jì)上讀取各孔的A值，分別檢測(cè)ColⅠ、TGF－β1和IGF－I的含量。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，以其均值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

圖像分析采用Image－Pro Plus 6.0分析系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞α－SMA、TGF－β1和IGF－I的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。每張細(xì)胞爬片隨機(jī)選5個(gè)視野，以細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，以顆粒的平均光密度值反映陽性細(xì)胞蛋白表達(dá)量。使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用單因素方差分析。

結(jié) 果

1 免疫組化結(jié)果

培養(yǎng)72 h后，對(duì)照組細(xì)胞有少量α－SMA陽性表達(dá)，幾無TGF－β1和IGF－Ⅰ陽性表達(dá);Ang－(1－7)組與之類似;AngⅡ組細(xì)胞α－SMA、TGF－β1和IGF－Ⅰ表達(dá)明顯增加;AngⅡ+Ang－(1－7)組與AngⅡ組比較，細(xì)胞α－SMA、TGF－β1和IGF－I表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，見表1、圖1。

表1 各組細(xì)胞α－SMA、TGF－β1和IGF－Ⅰ的表達(dá)Table 1.The expression of α － SMA，TGF － β1and IGF － I in the cells(.n=6)

表1 各組細(xì)胞α－SMA、TGF－β1和IGF－Ⅰ的表達(dá)Table 1.The expression of α － SMA，TGF － β1and IGF － I in the cells(.n=6)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs AngⅡ group.

Group α－SMA TGF－β1IGF－I Control 18.93±1.67 11.08±0.30 12.54±0.47 AngⅡ 76.70±5.38* 56.06±3.68* 48.02±2.07*Ang－(1－7) 24.77±1.01 15.86±0.68 12.09±0.74 AngⅡ +Ang－(1－7)31.16±1.83# 16.72±1.12# 17.87±0.93#

2 ELISA結(jié)果

培養(yǎng)72 h后，與對(duì)照組比較，Ang－(1－7)組細(xì)胞上清液中ColⅠ、TGF－β1和IGF－Ⅰ的含量無明顯改變，AngⅡ組細(xì)胞上清液中ColⅠ、TGF－β1和IGF－Ⅰ的含量明顯升高(P＜0.05)。與AngⅡ組比較，AngⅡ+Ang－(1－7)組細(xì)胞上清液中 ColⅠ、TGF－β1和 IGF－Ⅰ含量明顯減少(P＜0.05)，見表2。

表2 細(xì)胞上清液中ColⅠ、TGF－β1和IGF－Ⅰ的含量Table 2.The content of ColⅠ，TGF－β1and IGF－Ⅰ in the cultured supernatants(ng/L·.n=6)

表2 細(xì)胞上清液中ColⅠ、TGF－β1和IGF－Ⅰ的含量Table 2.The content of ColⅠ，TGF－β1and IGF－Ⅰ in the cultured supernatants(ng/L·.n=6)

*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs AngⅡgroup.

Group ColⅠ TGF － β1IGF－I Control 13.52 ±1.22 26.69 ±3.04 9.00 ±1.47 AngⅡ 15.43 ±1.14* 33.97 ±4.73* 11.19 ±1.67*Ang－(1 －7) 13.97 ±2.01 31.19 ±4.45 10.08 ±1.80 AngⅡ +Ang－(1 －7)13.32 ±1.12# 27.49 ±2.30# 7.49 ±1.30#

Figure 1.The expression of α－SMA，TGF－β1and IGF－Ⅰ detected by immunocytochemistry(×400).圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)α－SMA、TGF－β1和IGF－Ⅰ的表達(dá)

討 論

腎間質(zhì)纖維化是腎臟病發(fā)展至終末期腎功能衰竭的共同病理變化，成纖維細(xì)胞是腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。在病理情況下，各種致病因子使腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化成為表達(dá)α－SMA的肌成纖維細(xì)胞，后者具有分泌ECM和某些致纖維化因子和生長(zhǎng)因子的功能。因此，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞是造成腎間質(zhì)纖維化的重要環(huán)節(jié)［5］。

RAS是體內(nèi)重要的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)，機(jī)體局部和全身的激活可引起多種病理生理變化，腎間質(zhì)纖維化的出現(xiàn)與腎臟局部RAS密切相關(guān)。AngⅡ是RAS的主要成員，作為一種促生長(zhǎng)因子及促纖維化因子，它可以直接促進(jìn)多種細(xì)胞因子的生成、細(xì)胞增生、肥大以及基質(zhì)蛋白的積聚［6］。

以AngⅡ刺激體外分離培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AngⅡ可激活心肌成纖維細(xì)胞，并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如膠原和纖維連接蛋白的積聚，從而導(dǎo)致心臟重構(gòu)，心肌纖維化［7］。Burns等［1］的研究小組體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞，以AngⅡ干預(yù)3 d后，免疫細(xì)胞化學(xué)觀察到細(xì)胞α－SMA表達(dá)增加，而E－鈣黏蛋白表達(dá)減少，同時(shí)，RT－PCR也發(fā)現(xiàn)ColⅠ、ColⅣ和纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白mRNA的表達(dá)增加，說明AngⅡ可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，使細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)能力增強(qiáng)。本研究也觀察到AngⅡ誘導(dǎo)NRK－49F細(xì)胞在體外活化，表達(dá)肌成纖維細(xì)胞特異性蛋白α－SMA，并改變其分泌功能，使ColⅠ合成增加，與上述研究一致。我們的研究還發(fā)現(xiàn)Ang－(1－7)可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的NRK－49F細(xì)胞活化和ColⅠ的分泌增加。Burns等［1］進(jìn)一步以AngⅡ和Ang－(1－7)共同干預(yù)大鼠腎小管上皮細(xì)胞證實(shí)Ang－(1－7)可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符。由此可知，Ang－(1－7)在抑制腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮著重要作用。

在臟器纖維化形成的過程中，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)起著關(guān)鍵作用，其中TGF－β1是目前已知最重要的致纖維化細(xì)胞因子之一，其突出作用是增加細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成的同時(shí)減少其降解，改變ECM合成和降解的正常平衡，使細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多，最終引起纖維化。而IGF－I是一種結(jié)構(gòu)和功能與胰島素相似，能夠強(qiáng)有力刺激細(xì)胞合成代謝的生長(zhǎng)因子。已有大量研究表明，TGF－β1、IGF－I均可誘導(dǎo)多種細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并改變其分泌功能，加速臟器纖維化。Liu等［8］體外培養(yǎng)NRK－49F細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TGF－β1可使NRK－49F細(xì)胞活化，表達(dá)α－SMA增加。鄭法雷等［9］用IGF－I干預(yù)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞證實(shí)IGF－I也有與TGF－β1相同的作用，IGF－I呈劑量依賴性地誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，表達(dá)α－SMA，分泌細(xì)胞外基質(zhì)FN、ColⅠ增加。本研究發(fā)現(xiàn)，在AngⅡ引起NRK－49F細(xì)胞活化，膠原分泌增加的同時(shí)，細(xì)胞因子TGF－β1和IGF－I的表達(dá)也增加。本研究還觀察到Ang－(1－7)拮抗AngⅡ上述作用的同時(shí)也出現(xiàn)TGF－β1和IGF－I下調(diào)。因此，我們推測(cè)AngⅡ誘導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞，表達(dá)α－SMA，分泌ColⅠ增加可能與細(xì)胞因子TGF－β1、IGF－I上調(diào)有關(guān)，而Ang－(1－7)則通過抑制TGF－β1、IGF－I上調(diào)而拮抗AngⅡ的作用。

綜上，Ang－(1－7)可以抑制AngⅡ引起的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化，其機(jī)理可能與Ang－(1－7)下調(diào)細(xì)胞因子TGF－β1、IGF－I的表達(dá)有關(guān)。這對(duì)臨床治療腎臟纖維化，阻止慢性腎臟疾病的進(jìn)行性發(fā)展具有重要指導(dǎo)意義。

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