梁綺雯，饒本強(qiáng)，許 希，肖 剛，汪建平

(中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院1檢驗(yàn)科，2結(jié)直腸外科，廣東 廣州 510655;3廣州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

噬菌體展示技術(shù)自1985年Smith［1］利用基因工程手段所建立以來，已經(jīng)在抗原表位篩選、免疫學(xué)診斷、疫苗研制、藥物篩選、分子生物學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，更是目前腫瘤靶向治療靶標(biāo)篩選的最常用方法。但是，對(duì)于篩選跨膜受體靶向肽，該法尚不理想。3種常規(guī)的噬菌體淘洗方法:(1)用人工合成純化胞膜外段蛋白的淘選;(2)用完整的腫瘤細(xì)胞的差減淘選;(3)動(dòng)物體內(nèi)篩選實(shí)驗(yàn)［2］，均存在較多影響因素，如單一方法產(chǎn)生的非特異富集、細(xì)胞易脫落、合成蛋白變異、體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境等。本研究將純化受體淘選和腫瘤細(xì)胞淘選相結(jié)合，采用序貫篩選(受體－細(xì)胞序貫篩選法，screen for targeting receptor and cell alternately with phage display，STRCA法)這一特殊篩選方法篩選跨膜受體組織因子(tissue factor，TF)的靶向肽，為臨床實(shí)踐提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 試劑與細(xì)胞株

Ph.D.TM噬菌體隨機(jī) 7 肽庫(Ph.D.TM－7 Phage Display Peptide Library Kit)、測序引物 －96gШ(5'－HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG－3')和 E.coli ER2738宿主菌均購自 New England Biolabs(Lot:0121004);TF購自Calbiochem(Lot:D00063981);HT－29細(xì)胞株由本室保存;抗TF抗體購于R＆D(Lot:AF2339);辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記抗噬菌體M13單抗購自GE;HRP－馬抗羊Ⅱ抗購于北京鼎國公司;驢抗鼠－Cy3多抗購自ProteinTech Group(Lot:SA00009－3)。

2 方法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng) HT－29細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI－1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞于37℃、5%CO2孵箱中靜置培養(yǎng)，每隔3～4 d進(jìn)行傳代，培養(yǎng)3代后取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 免疫熒光法檢測HT－29細(xì)胞TF受體表達(dá) HT－29細(xì)胞接種在96孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，待細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)，孔內(nèi)細(xì)胞覆蓋率達(dá)95% ～98%時(shí)，4%多聚甲醛固定;含1%Triton X－100的PBS洗3次后，用1%胎牛血清封閉;加入1∶40稀釋的抗TF單抗，置于濕盒4℃過夜;除去Ⅰ抗，加入1∶40稀釋的驢抗鼠Cy3多抗，室溫避光孵育1 h，同時(shí)設(shè)立對(duì)照;除去Ⅱ抗，于熒光顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。

2.3 噬菌體肽庫序貫淘洗 實(shí)驗(yàn)采用純化受體與完整細(xì)胞交替進(jìn)行5輪篩選。第1輪純化受體淘洗:將TF(5 μg)過夜包被至聚苯乙烯培養(yǎng)皿 NUNC中，封閉劑作用2 h后，用0.05%TBST洗滌6次，加入1 mL PBS稀釋的10 μL噬菌體展示7肽庫(滴度為2.0×1011)，室溫30 r/min作用2 h，0.05%TBST洗滌 10次;150 μL 0.2 mol/L Gly－HCl(pH 2.2)30 r/min作用10 min后，用1 mol/L Tris·HCl(pH 9.1)中和液15 μL中和并收集洗脫液，此為經(jīng)第1輪體外篩選所得噬菌體。洗脫液經(jīng)滴度測定、擴(kuò)增后用于下一輪細(xì)胞篩選。第2輪細(xì)胞淘選:將HT－29接種NUNC板中，待72 h細(xì)胞基本長滿后，1%PBSM靜置封閉20 min，0.05%TBST洗滌2次，加入1 mL PBS稀釋的10 μL上一輪擴(kuò)增產(chǎn)物(滴度為2.0×1011)，室溫30 r/min作用1 h，0.1%TBST洗滌5次;150 μL 0.2 mol/L Gly－HCl(pH 2.2)30 r/min作用10 min后，用1 mol/L Tris·HCl(pH 9.1)15 μL中和并收集洗脫液，此為經(jīng)第2輪體外篩選所得噬菌體。第3、5輪篩選均以純化TF為靶標(biāo)，第4輪篩選以HT－29為靶標(biāo)。第4輪細(xì)胞篩選中，加入噬菌體作用時(shí)間遞減至0.5 h，洗滌液濃度提高到0.3%TBST，洗滌時(shí)間增加到2 min/10次，其余步驟如第2輪。第3輪和第5輪淘洗中 TF包被量逐次遞減2.5 μg、1.25 μg，加入噬菌體作用時(shí)間逐次遞減1 h、0.5 h，洗滌液濃度也逐步提高至0.1%TBST、0.5%TBST，其余步驟如第1輪。在第5輪中加入Gly－HCl(pH 2.2)后棄去，再重復(fù)加入 150 μL 0.2 mol/L Gly－HCl(pH 2.2)30 r/min作用10 min，用 1 mol/L Tris·HCl(pH 9.1)中和液15 μL中和并收集第2次洗脫液，測量第2次洗脫液的滴度。

2.4 高滴度單克隆噬菌體的制備 從小于100個(gè)噬菌體藍(lán)斑的LB/IPTG/X－gal平板培養(yǎng)板中挑選30個(gè)界限分明、生長良好的藍(lán)斑，將其分別接種于1 mL過夜ER2738的1∶100稀釋物中，37℃ 250 r/min擴(kuò)增4.5 h。經(jīng)2次4℃、12000×g離心10 min后，保存80%上清液即可。

2.5 ELISA檢測噬菌體陽性克隆 將HT－29接種96孔板中，待細(xì)胞長滿單層后，4%多聚甲醛固定;2%PBSM室溫靜置封閉1 h;0.05%PBST洗3次后分別加入109pfu稀釋單克隆噬菌體室溫30 r/min孵育1 h;用PBS作陰性對(duì)照;0.05%PBST洗3次后加入HRP－抗M13單抗，室溫30 r/min孵育1 h;TMB避光顯色20 min，加入終止液。于450/630 nm雙波長測定其A值。

2.6 測序模板快速純化 按照Ph.D.TM噬菌體隨機(jī)7肽庫說明書抽提單克隆噬菌體DNA，并將30個(gè)模板溶液送Invitrogen公司測序。

2.7 多肽合成 30個(gè)模板測序結(jié)果重復(fù)率高的4個(gè)序列進(jìn)行多肽合成，分別命名為A、B、C、D肽，E肽是A、B肽通過連接肽(Gly3Ser)4所合成，多肽純度均大于95%。

2.8 競爭抑制ELISA檢測合成多肽親和力 將HT－29接種96孔板中，待72 h細(xì)胞基本長滿后;4%多聚甲醛固定;2%PBSM室溫靜置封閉1 h;0.05%PBST洗3次;分別加入多肽A、B、C、D、E 系統(tǒng)稀釋(0、0.00002、0.0002、0.02、0.2、2 mmol/L)，與細(xì)胞室溫30 r/min離心孵育1 h;用PBS作陰性對(duì)照;0.05%PBST洗3次;加入羊抗TF抗體，室溫30 r/min離心孵育1 h;0.05%PBST洗3次，加入馬抗羊IgG抗體，室溫30 r/min離心孵育1 h;0.05%PBST洗3次，TMB避光顯色20 min，加入終止液。于450/630 nm雙波長測定其A值。

2.9 重復(fù)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照建立的方法重復(fù)進(jìn)行第2次的5輪序貫篩選，所用試劑均是與上述實(shí)驗(yàn)為同一廠家、同一批號(hào)的試劑，實(shí)驗(yàn)環(huán)境、操作人員均保持不變。

結(jié) 果

1 HT－29細(xì)胞異常高表達(dá)TF

免疫熒光法檢測HT－29細(xì)胞膜TF表達(dá)情況，由圖1可見絕大多數(shù)HT－29細(xì)胞膜呈現(xiàn)強(qiáng)紅色熒光，表明有TF異常高表達(dá)。而陰性對(duì)照則基本不發(fā)出熒光信號(hào)。

Figure 1.Immunofluorescent staining of HT－29 colon cancer cells(×200).Strong TF expression was found in HT－29 colon cancer cells(A)but negative in the control(B).圖1 HT－29細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果

2 生物篩選

每輪回收率如表1所示，第1、3、5輪篩選中回收率明顯呈階梯狀上升，第2、4輪細(xì)胞篩選回收率也有輕微上升，細(xì)胞篩選富集較慢?？傮w回收率由(2.25×10－4)%增加到(1.32×10－2)%，可見通過5輪淘選對(duì)噬菌體隨機(jī)7肽庫進(jìn)行選擇性的富集，富集度達(dá)58.6倍。

表1 噬菌體7肽庫5輪篩選的選擇性富集效應(yīng)Table 1.Selective enrichment of phage heptapeptide library through 5 rounds of panning

3 陽性噬菌體克隆對(duì)HT－29結(jié)合活性鑒定

直接法ELISA初步鑒定30個(gè)克隆與HT－29結(jié)合活性，見圖2。以A值高出陰性對(duì)照(A值為0.064)3倍以上為陽性，陽性率為76.7%。初步確定篩選的噬菌體克隆能與TF特異性結(jié)合。

Figure 2.The affinity of the phage clones to HT －29 cells.圖2 ELISA檢測噬菌體克隆與HT－29細(xì)胞的親和力

4 序列分析

30個(gè)噬菌體克隆DNA測序結(jié)果中，4種肽(分別命名為A、B、C、D 肽)的總重復(fù)率高達(dá)83.3%，其中 A 肽重復(fù)率為23.3%(7/30)，B 肽為 23.3%(7/30)，C 肽為 26.7%(8/30)，D肽為10%(3/30)，表明經(jīng)過5輪篩選，取得較高的特異性和富集效果。經(jīng)搜索BLAST數(shù)據(jù)庫，均未發(fā)現(xiàn)與以上4個(gè)多肽具有良好同源性有意義的蛋白序列，表明我們篩選到一種的新的TF靶向肽。

5 競爭抑制ELISA檢測合成多肽親和力

合成多肽A、B、C、D、E與抗TF抗體競爭結(jié)合HT－29細(xì)胞，在450/630 nm雙波長下分別測定其A值。5種肽IC50分別為 3.25 nmol/L、6.72 mol/L、3.24 × 103mol/L、2.08 × 102mol/L和45.77 mol/L。A值越低，說明人工合成多肽與 TF的親和力越高，其中以多肽A親和力最高，并且呈劑量依賴性。E肽親和性不如單一的A、B肽。5種合成肽ELISA競爭抑制曲線見圖3。

Figure 3.The competitive inhibitory effect of five synthetic peptides(A，B，C，D，E)on the binding of HT －29 cells.圖3 5種合成肽的競爭抑制曲線

6 實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性

實(shí)驗(yàn)按照我們建立的方法重復(fù)進(jìn)行第2次的5輪序貫篩選，獲得的陽性噬菌體克隆序列與第1次實(shí)驗(yàn)所獲得的相比，重復(fù)率為33.3%，其中包括在第1次篩選中有高親和性的A肽。

討 論

目前篩選跨膜受體靶向肽尚未有理想的噬菌體展示方法。普遍采用以合成的胞外區(qū)多肽為靶標(biāo)的篩選方法［3］，但獲得的結(jié)果存在局限性，原因是:(1)體外人工合成胞外段短肽盡管一級(jí)結(jié)構(gòu)上與天然多肽保持一致，但是由于缺乏跨膜段和細(xì)胞內(nèi)段，其僅能模擬多肽的線性表位，無法呈現(xiàn)構(gòu)象性表位信息，可能導(dǎo)致變異;(2)而且合成胞膜外段工藝復(fù)雜，驗(yàn)證過程繁瑣;(3)篩選結(jié)果偶然性較大，重復(fù)率低。

有鑒于此，本實(shí)驗(yàn)建立的篩選特定跨膜受體胞膜外段靶向片段的噬菌體方法具有3個(gè)特點(diǎn):(1)本文不采用人工合成TF胞外段為靶標(biāo)的方法進(jìn)行篩選，而直接采用純化TF受體為靶標(biāo)，目的是盡可能保持TF天然構(gòu)象和生物活性，減少變異帶來的假陽性結(jié)果;(2)HT－29細(xì)胞上異常表達(dá)大量TF受體。利用HT－29為靶標(biāo)，與純化TF受體進(jìn)行序貫篩選，既可以避免篩選出來的噬菌體與HT－29細(xì)胞表面其它受體非特異性結(jié)合，也可避免與純化TF的跨膜區(qū)或細(xì)胞內(nèi)區(qū)結(jié)合;(3)實(shí)驗(yàn)中并沒有出現(xiàn)野生型噬菌體的偏嗜性現(xiàn)象，陽性噬菌體克隆亦具有較高的再現(xiàn)率。

本研究對(duì)于實(shí)驗(yàn)條件采取嚴(yán)格的控制:在第1輪淘洗中，為了保證篩選出來的噬菌體種類足夠多，特別是低親和、高特異性克隆能同樣得到擴(kuò)增，先采用擴(kuò)增效率較高的以TF為靶標(biāo)的篩選方法，同時(shí)采用嚴(yán)謹(jǐn)度較低的篩選強(qiáng)度。噬菌體展示技術(shù)使用單一方法進(jìn)行篩選時(shí)不可避免存在非特異性吸附，非特異噬菌體在篩選過程中同樣被吸附、洗脫、擴(kuò)增而被保留下來［4］。因此在第2輪中我們換用了以HT－29為靶標(biāo)的方法，雖然富集效率有所降低，但是有效地去除上一輪中因非特異吸附而富集的噬菌體。整個(gè)淘選過程在以純化受體與完整細(xì)胞交替為靶標(biāo)序貫進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)選擇適當(dāng)嚴(yán)謹(jǐn)度的篩選條件［5］，包括采取遞減包被受體的濃度，遞增洗滌液濃度，延長洗脫時(shí)間和增加洗脫次數(shù)的方法，并收集最后一輪淘選的第2洗脫液等方法，以期獲得高特異性和高親和性的噬菌體。

我們篩選的結(jié)果，4種肽序列的總重復(fù)率高達(dá)83.3%，重復(fù)進(jìn)行第2次實(shí)驗(yàn)，出現(xiàn)相同陽性噬菌體序列為33.3%，表明優(yōu)勢序列得到富集，且具有可重復(fù)性［6］。為了排除噬菌體克隆表面其它蛋白受體與目的靶蛋白結(jié)合假陽性的可能，本文利用競爭抑制ELISA檢測比較各合成肽的TF親和力，其中A肽IC50為3.25 nmol/L，出現(xiàn)頻率亦較高，疏水性高且?guī)д姾?，是理想的針?duì)腫瘤細(xì)胞特異表達(dá)TF的靶向肽。

實(shí)驗(yàn)中根據(jù)篩選結(jié)果選擇重復(fù)率高的A、B肽，通過連接肽(Gly3Ser)4構(gòu)建成復(fù)合肽E，期望所構(gòu)建的復(fù)合肽發(fā)揮更強(qiáng)大的特異靶向作用，但通過競爭抑制 ELISA未證明其優(yōu)越性，反而其親和性不如單一的A、B肽，原因可能為:(1)親和性高的A、B肽之間存在相互競爭，限制復(fù)合肽E結(jié)合力;(2)A、B肽之間的連接肽無法將A、B肽充分隔離，空間位阻使復(fù)合肽E結(jié)合力下降。

TF是能與因子VII/VIIa結(jié)合而啟動(dòng)外源性凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的跨膜糖蛋白，且能作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一員與蛋白酶激活受體(protease－activated receptors，PARs)結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與腫瘤細(xì)胞生長、侵潤、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管形成的過程，可能成為一個(gè)新型的腫瘤標(biāo)志物［7－8］?；赥F的臨床應(yīng)用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)以TF為研究對(duì)象，對(duì)噬菌體隨機(jī)7肽庫進(jìn)行5輪序貫淘洗，成功篩選A肽，憑借其分子量小、與TF高特異親和性、合成和純化簡便，在臨床應(yīng)用勢必有廣闊的前景，本文擬在本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來鑒定多肽特異性、免疫原性等，為今后應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

固相噬菌體展示技術(shù)對(duì)篩選暫無法完全了解結(jié)構(gòu)與功能的靶蛋白的高親和配體有其無可比擬的優(yōu)越性，但這種方法是針對(duì)特定的受體一種盲篩的方法，存在偶然性，肽庫的多樣性也在一定程度被噬菌體轉(zhuǎn)染宿主菌的效率所限制，而且多輪篩選使野生型噬菌體擴(kuò)增而產(chǎn)生假陽性。本研究創(chuàng)新性將純化受體和完整細(xì)胞進(jìn)行序貫淘洗，獲得獨(dú)特與TF胞外段結(jié)合的噬菌體克隆，而且并未出現(xiàn)野生型噬菌體偏嗜性，陽性克隆再現(xiàn)性高。作為一種優(yōu)化方法，STRCA法噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用于篩選跨膜受體靶向肽具有現(xiàn)實(shí)意義。

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