么曉軼，于紀(jì)珠，李 穎

(1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院老年病科，黑龍江 哈爾濱 150086;2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院大橋分院，黑龍江 哈爾濱 150006)

大量實(shí)驗(yàn)證明雌激素可以通過不同方式對(duì)腦梗死病理過程發(fā)生作用，從而對(duì)腦缺血損傷起到保護(hù)作用，但雌激素存在的許多負(fù)面作用及其性別限制其在臨床上得以廣泛應(yīng)用。植物雌激素結(jié)構(gòu)與人體分泌的雌激素十分相似，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物雌激素17β－雌二醇相似，都有1對(duì)羥基及1個(gè)酚環(huán)，這種結(jié)構(gòu)的相似性決定了它們具有一定的雌激素活性，可以和內(nèi)源性雌激素受體(estrogen receptor，ER)結(jié)合，而表現(xiàn)出類似雌激素樣的作用，摒棄動(dòng)物雌激素缺陷。Calpain是一種鈣依賴性蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白酶中香木瓜蛋白酶家族成員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛存在。Calpain和caspase－3都屬于半胱氨酸蛋白酶家族，都可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，二者在腦缺血后作用于半暗帶神經(jīng)元，促進(jìn)凋亡［1］。已有研究證明17β－雌二醇對(duì)大鼠缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用［2－3］，因此推斷植物雌激素也可能具有類似作用。本文以大豆異黃酮作為植物雌激素的典型代表，研究植物雌激素對(duì)缺血再灌注腦組織的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑與儀器

大豆異黃酮購自九三油脂集團(tuán)(純度為40%)，原位TUNEL試劑盒購自羅氏公司，calpain多克隆抗體和原位雜交試劑盒購自武漢博士得生物工程有限公司。DAB染色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Tris－HCl、EGTA、DTT、考馬斯亮藍(lán)G250、β －硫基乙醇、Lowry蛋白定量試劑盒和溶血腦磷脂均購自Sigma。

2 動(dòng)物分組

成年健康雌性SD大鼠36只，月齡2～3個(gè)月，制作雙側(cè)卵巢切除術(shù)時(shí)體重180～220 g，制作腦缺血再灌注模型時(shí)體重230～280 g。所有動(dòng)物均將雙側(cè)卵巢切除，隨機(jī)分為3組:大豆異黃酮大劑量組12只、小劑量組12只、模型組12只。大劑量組按120 mg·kg－1·d－1灌胃給藥，小劑量組按 60 mg·kg－1·d－1灌胃給藥，模型組給予等量生理鹽水灌胃。各組動(dòng)物喂養(yǎng)1個(gè)月后，按改良的Longa法［4］行左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻斷模型，應(yīng)用黑色5/0尼龍線栓自頸總動(dòng)脈的切口插入，沿頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈順行向上插入大腦中動(dòng)脈的起始部，遇阻力停止，從頸總動(dòng)脈分叉處計(jì)算插入深度1.7～1.8 cm，造成大腦中動(dòng)脈阻斷。缺血2 h后，無需要再次麻醉，輕輕抓握動(dòng)物將栓線后拔退至頸總動(dòng)脈，即恢復(fù)大腦中動(dòng)脈的血供。術(shù)后動(dòng)物清醒后右側(cè)肢體出現(xiàn)Horner氏征，并采用5分制進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分以證明腦缺血模型成功。

3 方法

3.1 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)

3.1.1 HE染色 各組大鼠再灌注22 h后取材。于視交叉前后各2 mm冠狀切片，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲醛透明，浸蠟，包埋，制成蠟塊，切成厚約4 μm的薄片，在各個(gè)標(biāo)本的同一位置連續(xù)做3張切片，分別用于HE染色，光鏡下定性觀察。

3.1.2 原位雜交檢測(cè)calpain mRNA的表達(dá) 操作如下:切片常規(guī)脫蠟至水，新鮮配制的0.5%H2O2/甲醇室溫處理30 min，經(jīng)3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶37℃消化1 min，每片加20 μL預(yù)雜交液，37℃作用2 h，再加20 μL雜交液4℃雜交過夜，經(jīng)梯度洗滌后，滴加封閉液，37℃作用30 min，再依次滴加生物素化鼠抗地高辛，SABC復(fù)合物和生物素化過氧化物酶作用后，用新配制的0.01%H2O2/0.04%DAB室溫顯色10 min，充分水洗，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞為棕黃色染色。用PBS代替雜交探針作為陰性對(duì)照片。Calpain mRNA陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)方法:由對(duì)實(shí)驗(yàn)不知情者在高倍鏡(×400)下分別計(jì)數(shù)相鄰腦片中缺血側(cè)陽性細(xì)胞數(shù)。光鏡下在缺血測(cè)梗死灶周圍選擇5個(gè)不重疊的視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下每100個(gè)細(xì)胞中陽性染色的細(xì)胞數(shù)，然后除以5，所得數(shù)據(jù)作為1個(gè)動(dòng)物標(biāo)本的calpain mRNA陽性細(xì)胞數(shù)。

3.1.3 原位末端標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 使用DAB顯色試劑盒。著棕黃色為凋亡細(xì)胞，定義為陽性細(xì)胞。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)方法:400倍光鏡下在缺血側(cè)梗死灶周圍選擇5個(gè)不重疊視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下每100個(gè)細(xì)胞中陽性染色的細(xì)胞數(shù)，然后除以5，所得數(shù)據(jù)作為1個(gè)動(dòng)物標(biāo)本的陽性細(xì)胞數(shù)。

3.2 Calpain活性測(cè)定［5］大鼠迅速斷頭取腦，冰浴上分離出缺血側(cè)皮層制成10%的組織勻漿以測(cè)定calpain活性。將皮層組織加入20 μmoL/L Tris－HCl緩沖液pH=7.4，在冰浴上用玻璃勻漿器將其制成組織勻漿，在4℃條件下1000×g離心8 min，取上清液置4℃冰箱待測(cè)calpain活性。1管為無Ca2+體系，內(nèi)含酪蛋白 0.4 mg，12 mmol/L Tris － HCl，1 mmol EGTA及上清液40 mL;另1管除用1 mmol/L CaCl2代替EGTA外，管內(nèi)其它物質(zhì)均相同。25℃反應(yīng)30 min后依次向各層加入蒸餾水3.0 mL，考馬斯亮藍(lán)G250染液0.8 mL，充分混合10 min測(cè)595 nm吸光度值(A值)。每個(gè)樣品calpain活性用各相應(yīng)的無鈣管吸光度A值減去有鈣管A值所得差值來計(jì)算，蛋白定量采用Lowry法。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，用方差分析(ANOVA)進(jìn)行分析處理。用直線相關(guān)分析法判定兩變量間的相關(guān)情況，相關(guān)系數(shù)r的假設(shè)檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 光鏡定性觀察

大、小劑量大豆異黃酮組皮質(zhì)區(qū)可見大部分神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)尚正常，胞質(zhì)、胞核清晰可見，內(nèi)有核仁，少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞輕度腫脹，細(xì)胞周圍間隙略增寬，神經(jīng)細(xì)胞呈三角形或多角形。模型組皮質(zhì)區(qū)大部分神經(jīng)細(xì)胞軸突消失，細(xì)胞周圍的間隙明顯增寬，胞間距離增大，神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，神經(jīng)細(xì)胞呈三角形或圓形，胞核固縮、核碎裂或消失，一些神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，并有局部腦區(qū)的液化性壞死，見圖1。

Figure 1.Morphological changes of the ischemic cortex(HE staining，× 400).A:FCIR(focal cerebral ischemia and reperfusion)group;B:low－dose soybean isoflavone－treated group;C:high－dose soybean isoflavone－treated group.圖1 缺血皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

2 腦缺血再灌注側(cè)calpain mRNA陽性細(xì)胞的分布和數(shù)量

Calpain陽性細(xì)胞的胞漿呈棕色。3組缺血再灌注側(cè)腦組織均有大量calpain表達(dá)，而缺血對(duì)側(cè)腦組織僅有少量的calpain mRNA的表達(dá)。陽性細(xì)胞廣泛分布于缺血側(cè)的皮質(zhì)區(qū)，梗死灶周圍半暗帶區(qū)表達(dá)較強(qiáng)。大豆異黃酮組與模型組比較，calpain的表達(dá)顯著減弱，不同劑量藥物干預(yù)組calpain mRNA陽性細(xì)胞數(shù)量相近，無明顯差異，見圖2、表1。

Figure 2.Expression of calpain mRNA in the ischemic cortex(DAB staining，×400).A:FCIR group;B:low－dose soybean isoflavone－treated group;C:high－dose soybean isoflavone－treated group.圖2 腦缺血側(cè)皮層calpain mRNA表達(dá)

表1 各實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)、calpain mRNA陽性細(xì)胞數(shù)和calpain活性變化Table 1.Comparison of apoptotic cells，calpain mRNA positive cells and activity of calpain in different groups(.n=6)

表1 各實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)、calpain mRNA陽性細(xì)胞數(shù)和calpain活性變化Table 1.Comparison of apoptotic cells，calpain mRNA positive cells and activity of calpain in different groups(.n=6)

△P ＜0.05 vs FCIR group.SIF:soybean isoflavones.

Group Dose Apoptotic cells Calpain mRNA posit ive cells Activity of calpain FCIR － 38.67 ±4.03 70.97 ±1.25 2.23 ±0.25 Low －dose SIF 60 mg·kg－1·d－1 32.13 ±3.45△ 65.43±1.74△ 1.87±0.12△High－dose SIF 120 mg·kg－1·d－1 30.20 ±1.90△ 64.87±2.10△ 1.94±0.31△

3 腦缺血再灌注側(cè)calpain活性的變化

腦缺血再灌注側(cè)皮層calpain活性明顯升高，大豆異黃酮組缺血再灌注側(cè)calpain活性顯著下降，與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05);不同劑量藥物預(yù)處理組calpain活性相近，兩藥物組對(duì)比無明顯差異(P＞0.01)，見表1。

4 腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡情況

細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為TUNEL陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。凋亡細(xì)胞染色不均，多集中在核膜下，呈不規(guī)則環(huán)形，可見核固縮及碎裂。凋亡細(xì)胞主要分布于大腦中動(dòng)脈供血區(qū)的額頂葉皮層，以梗死灶周邊區(qū)密度最高，而梗死灶中心細(xì)胞丟失，無陽性染色。凋亡細(xì)胞的分布區(qū)域與calpain mRNA陽性細(xì)胞的分布相符合。模型組缺血皮層TUNEL染色陽性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)在缺血半暗帶密集成簇，在藥物組缺血皮質(zhì)的周圍凋亡細(xì)胞零星散在，數(shù)量明顯減少，與模型組相比，差異顯著(P＜0.05)。各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況見圖3、表1。

Figure 3.The neuronal apoptotic cells in cortical ischemic regions(DAB staining，×400).A:FCIR group;B:low －dose soybean isoflavone－treated group;C:high－dose soybean isoflavone－treated group.圖3 缺血側(cè)皮層腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡

5 神經(jīng)細(xì)胞的凋亡程度與calpain活性的相關(guān)性分析

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)將同批次各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)和calpain活性兩兩相對(duì)應(yīng)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示，神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)與calpain活性呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.874，P＜0.01)。去勢(shì)雌性大鼠腦缺血再灌注后缺血腦組織calpain活性增強(qiáng)，從而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

討 論

大豆異黃酮分為游離型的苷元和結(jié)合型的糖苷兩類，游離型的甙元中染料木黃酮和大豆黃素為含有芳香環(huán)的非類固醇化合物，它們的結(jié)構(gòu)與雌激素相似，故有植物性雌激素之稱?，F(xiàn)有的研究已證實(shí)植物雌激素具有抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用。唐決等［6］人在肝臟的缺血模型中發(fā)現(xiàn)染料木黃酮預(yù)處理后，肝組織病理損傷明顯減輕，肝組織caspase－3蛋白表達(dá)及丙二醛濃度顯著降低。在大鼠和家兔的心肌缺血再灌注模型中證實(shí)植物雌激素可減輕心肌細(xì)胞的凋亡［7－8］。

在器官缺血時(shí)，發(fā)生細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，calpain被激活。Calpain過度激活參與了缺血性腦損傷的病理過程，現(xiàn)有的研究在不同種動(dòng)物的多種腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)calpain的活化，但在其活性的變化與缺血再灌注時(shí)間的關(guān)系上，不同的實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論不盡相同［9－10］，多數(shù)研究證實(shí)calpain活性的變化在腦缺血再灌注后呈雙峰式。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明大鼠腦缺血再灌注后calpain表達(dá)增加，參與腦缺血損傷過程，與以往文獻(xiàn)結(jié)果一致。Calpain表達(dá)在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中具有重要作用，由目前研究文獻(xiàn)推斷calpain參與凋亡的機(jī)制可能有如下幾個(gè)方面:calpain裂解caspase－3等產(chǎn)生活性片段，活性caspase－3水解calpastatin，反過來增加 calpain 活性［11］，促進(jìn)凋亡。Calpain激活caspase－3后，除與 caspase的關(guān)系外，還通過激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)介導(dǎo)了腦缺血神經(jīng)元延遲性死亡［12］。Chae 等［13］的研究，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物雌激素能夠通過抑制calpain介導(dǎo)的Bid的裂解發(fā)揮對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，降低calpain和caspase－8的活性，這提示雌激素樣物質(zhì)在腦組織的缺血性損傷中也有可能具有相似的作用。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注22 h后calpain mRNA的陽性細(xì)胞數(shù)在缺血半暗帶明顯增多，calpain的活性也同步上升，相關(guān)分析結(jié)果顯示神經(jīng)細(xì)胞的凋亡程度與calpain的活性呈正相關(guān)。大豆異黃酮組與模型組相比，calpain表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡均明顯減少，calpain的活性顯著下降。由此推斷大豆異黃酮通過減弱calpain的表達(dá)來阻止腦缺血再灌注損傷，進(jìn)而起到腦保護(hù)作用。

以往的研究顯示:與雌激素相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使異黃酮能夠與雌激素受體結(jié)合，從而表現(xiàn)出雌激素活性和抗雌激素活性，至于表現(xiàn)為何種活性主要取決于其局部濃度、內(nèi)源性雌激素水平以及組織器官的水平［14］。最新的研究表明，在永久性大腦中動(dòng)脈阻塞大鼠模型中，大豆異黃酮從10 mg·kg－1·d－1增至50 mg·kg－1·d－1時(shí)，其對(duì)腦組織的保護(hù)作用明顯增強(qiáng)［15］。這說明攝入量在 10 mg·kg－1·d－1至50 mg·kg－1·d－1之間時(shí)，大豆異黃酮的腦保護(hù)作用與劑量大小呈正相關(guān)。但目前有關(guān)大豆異黃酮對(duì)缺血腦組織發(fā)揮保護(hù)的最小劑量尚無報(bào)道，這有待我們進(jìn)一步的探討。在本實(shí)驗(yàn)中，120 mg·kg－1·d－1與60 mg·kg－1·d－1組比較，它們對(duì) calpain 的表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡無明顯差異，這說明大鼠的攝入量在60 ～120 mg·kg－1·d－1之間大豆異黃酮對(duì)缺血再灌注腦組織具有保護(hù)作用，但在此范圍內(nèi)它的保護(hù)作用并未隨著劑量的增加而提高，因?qū)嶒?yàn)條件所限對(duì)于此范圍以外的劑量我們未進(jìn)一步探究。本研究表明植物雌激素大豆異黃酮在缺血性腦損傷中起到神經(jīng)保護(hù)作用，通過下調(diào)calpain的表達(dá)和降低calpain活性減輕缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞的凋亡可能是其發(fā)揮此作用的機(jī)制之一。

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