李 巖， 唐可欣， 李 宏， 張 杰， 成 敏

(濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053)

糖尿病是臨床常見病和多發(fā)病，而血管病變是其慢性并發(fā)癥的主要表現(xiàn)，嚴(yán)重影響著糖尿病患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。研究顯示糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生與內(nèi)皮功能受損密切相關(guān)［1］，因此減少血管內(nèi)皮損傷，對(duì)防治糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展具有重要的臨床意義。

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一類能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞［2］。EPCs可以歸巢到內(nèi)皮損傷及缺血部位，維持血管內(nèi)皮組織的完整性［3］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)EPCs的來源、形態(tài)、增殖能力、分化能力以及基因表達(dá)、功能等方面的不同，可將EPCs分為早期EPCs和晚期EPCs兩種類型［4－5］。晚期 EPCs因其典型的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和高增殖潛力被認(rèn)為是真正的EPCs，在臨床應(yīng)用方面極具前景［6］。

文獻(xiàn)證實(shí)，糖尿病患者特別是合并有血管疾病的糖尿病患者外周血中EPCs的數(shù)量減少［7－8］。而糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病。因此，有必要進(jìn)一步研究高糖對(duì)晚期EPCs功能的影響。本研究探討了體外培養(yǎng)條件下，不同濃度葡萄糖對(duì)晚期EPCs增殖、遷移、黏附能力及分泌單核細(xì)胞趨化蛋白－1(monocyte chemoattractant protein－1，MCP－1)、白細(xì)胞介素 －8(interleukin－8，IL－8)的影響，旨在深入了解糖尿病血管合并癥的發(fā)病機(jī)制，為其臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料與試劑

雄性SD大鼠，體重100～150 g(中國(guó)人民解放軍第89醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(Peprotech);M199(Gibco);胎牛血清(杭州四季青生物公司);HISTOPAQUE－1083、MTT及 FITCUEA－1(Sigma);Dil－ac－LDL(MolecularProbe);FITC－CD133及PE－VEGFR－2(BD);50%葡萄糖(濟(jì)南利民制藥有限責(zé)任公司);人纖維連接蛋白(Chemicon);改良的Boyden小室(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠);大鼠MCP－1及IL－8 ELISA試劑盒(上海凱博生物有限公司)、Trizol(Invitrogen)，TaKaRa RNA PCR kit(AMV)3.0(大連寶生物工程有限公司)。引物由上海生物工程有限公司合成。

2 EPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

2.1 EPCs的分離培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死大鼠，75%乙醇浸泡10 min，剪后肢，去皮，入超凈臺(tái)剔除肌肉組織，暴露骨髓腔，粗端插20號(hào)針頭沖洗液沖洗至無色。將骨髓細(xì)胞懸液以1000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用PBS制成懸液，以3∶4比例輕置于分離液表面，2000 r/min離心30 min，吸取中間白色細(xì)胞層，加5 mL PBS洗滌2次(1400 r/min離心5min)，棄上清，用完全 M199 培養(yǎng)液(含 15%FBS、VEGF 10 μg/L、bFGF 5 μg/L)重懸，將其接種于預(yù)先包被有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶中，置37℃含5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 d后更換培養(yǎng)液。

2.2 EPCs的鑒定

①細(xì)胞染色與鑒定 將培養(yǎng)7 d的細(xì)胞以0.25%胰酶/0.02%EDTA消化，接種于蓋玻片上，細(xì)胞爬片成功后，加入2.4 mg/L DiI－ac－LDL，37℃避光孵育1 h，2%多聚甲醛固定10 min，PBS液漂洗后加入10 mg/L FITC－UEA－1避光孵育1 h，PBS液漂洗后在熒光顯微鏡下觀察。

②基因鑒定 取培養(yǎng)第3代的EPCs，檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物 von Willebrand因子(von Willebrand factor，vWF)和血管內(nèi)皮型鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE－cadherin)mRNA的表達(dá)。用 Trizol抽取細(xì)胞總 RNA，采用 TaKaRa RNA PCR kit(AMV)3.0試劑盒合成cDNA。vWF:上游引物5'－GCGTGGCAGTGGTAGAGTA －3'，下游引物 5'－GGAGATAGC GGGTGAAATA －3'，擴(kuò)增片段245 bp。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。VE－cadherin:上游引物5'－CCACTGTGCTGATCAGATTGGAA －3'，下游引物 5'－GAGGCTCATCTGGGTCCTCAAC －3'，擴(kuò)增片段 141 bp。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。內(nèi)參 GAPDH:上游引物5'－GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG－3'，下游引物5'－ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA －3'，擴(kuò)增片段143 bp。PCR產(chǎn)物以3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，長(zhǎng)波紫外燈下觀測(cè)照相。

③流式細(xì)胞檢測(cè) 將第3代的細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，取1×106細(xì)胞行CD133－FITC(1∶50)及VEGFR－2－PE(1∶100)染色，另取1×106細(xì)胞加入同型對(duì)照，4℃避光孵育30 min。染色完畢后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133及VEGFR－2的表達(dá)。應(yīng)用Cell Quest軟件進(jìn)行分析。

3 實(shí)驗(yàn)分組

選取第3代EPCs作為靶細(xì)胞。細(xì)胞隨機(jī)分為:(1)正常對(duì)照組:葡萄糖濃度為 5 mmol/L［9］;(2)高濃度葡萄糖組:葡萄糖濃度分別為10﹑20和40 mmol/L;(3)高滲透壓對(duì)照組:5 mmol/L葡萄糖+35 mmol/L 甘露醇［10］。

4 MTT實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后以完全培養(yǎng)液重懸，以3000 cells/well的密度接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后按分組給予不同濃度葡萄糖。葡萄糖干預(yù)48 h后在每孔(含100 μL培養(yǎng)液)中加入10 μL MTT溶液(5 g/L)，4 h后小心吸棄上清，每孔加150 μL DMSO振搖10 min，酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)490 nm處)測(cè)其A值。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

5 遷移實(shí)驗(yàn)

按上述方法收集貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將200 μL培養(yǎng)液和VEGF(50 μg/L)加入改良的Boyden小室的下室，2×104EPCs懸浮液注入上室，24 h后，刮去濾膜上面的未移動(dòng)細(xì)胞，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，DAPI染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(×200)，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞，取其平均數(shù)。

6 黏附實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞消化后，按照3×107/L接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)，不同濃度葡萄糖(5、10、20和40 mmol/L)干預(yù) 48 h后以 0.25% 胰酶/0.02%EDTA消化，收集細(xì)胞。然后將同等數(shù)目的EPCs接種在包被有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)板中，37℃下培養(yǎng)30 min，PBS洗滌去除未貼壁細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選取9個(gè)視野(200倍)，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞，取其平均數(shù)。

7 ELISA

細(xì)胞消化后，按照3×107/L接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)，以不同濃度葡萄糖(5、10、20和40 mmol/L)干預(yù)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，按說明書操作，測(cè)定上清中MCP－1和IL－8含量。具體方法如下:將100 μL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品或樣品加至已包被有抗體的酶標(biāo)板中，空白對(duì)照孔中加入稀釋液100 μL，37℃孵育150 min;洗滌后加入酶標(biāo)抗體，37℃孵育60 min;反應(yīng)完成后，顯色;顯色終止后在492 nm處行酶標(biāo)儀掃描檢測(cè)。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～4次。采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 EPCs的培養(yǎng)與鑒定

剛分離的單個(gè)核細(xì)胞大多呈懸浮生長(zhǎng)，培養(yǎng)4 d后，貼壁細(xì)胞數(shù)量增多且呈梭形，培養(yǎng)7 d的細(xì)胞有集落樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，傳至第3代(培養(yǎng)21 d)的細(xì)胞呈明顯鋪路石樣外觀，見圖1。培養(yǎng)7 d的細(xì)胞經(jīng)DiI－ac－LDL和 FITC －UEA －1染色，83.5% ±9.2%的細(xì)胞為雙熒光染色陽(yáng)性［紅色熒光為ac－LDL陽(yáng)性細(xì)胞，綠色熒光為UEA－1陽(yáng)性細(xì)胞，雙熒光陽(yáng)性(黃色)細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs］，見圖2。第3代EPCs，RT－PCR結(jié)果顯示:內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物vWF和VE－cadherin表達(dá)陽(yáng)性，見圖3。FASC結(jié)果顯示:干細(xì)胞標(biāo)志物CD133陽(yáng)性細(xì)胞率為8.3% ±1.2%，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VEGFR－2陽(yáng)性細(xì)胞率為87.6% ±8.2%，見圖 4。

Figure 1.Morphology of EPCs from bone marrow(×100).A:four days after plating;B:seven days after plating;C:twenty－one days after plating.圖1 培養(yǎng)不同時(shí)期EPCs的形態(tài)學(xué)觀察(×100)

Figure 2.Characterization of early EPCs from bone marrow observed under fluorescent microscope(×200).A:DiI－ac－LDL;B:FITC－UEA－1;C:DiI－ac－LDL+FITC－UEA－1.圖2 熒光顯微鏡鑒定早期EPCs

Figure 3.The mRNA expression of vWF and VE－cadherin in late EPCs(RT－PCR).Marker:TaKaRa DL500 DNA marker，containing 7 DNA fragments:500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，150 bp，100 bp and 50 bp.vWF:245 bp;VE －cadherin:141 bp;GAPDH:143 bp.圖3 RT－PCR鑒定體外培養(yǎng)的晚期EPCs

Figure 4.Expression of CD133 and VEGFR－2 on late EPCs(FACS).圖4 FACS鑒定體外培養(yǎng)的晚期EPCs

2 高糖對(duì)EPCs增殖、遷移及黏附的影響

與正常葡萄糖處理組(5 mmol/L)相比，高濃度葡萄糖干預(yù)可濃度依賴性抑制晚期EPCs的增殖及遷移能力(P＜0.05，P＜0.01)，而高滲透壓對(duì)照組與5 mmol/L葡萄糖組相比無顯著差異，見圖5、6。高濃度葡萄糖亦抑制晚期EPCs的黏附能力，與正常葡萄糖處理組(5 mmol/L)相比，40 mmol/L葡萄糖處理明顯降低晚期EPCs的黏附能力(P＜0.05)，而高滲透壓對(duì)照組與5 mmol/L葡萄糖組相比無顯著差異，見圖7。

Figure 5.The effects of high glucose on the proliferation of late EPCs.1:5 mmol/L glucose;2:10 mmol/L glucose;3:20 mmol/L glucose;4:40 mmol/L glucose;5:5 mmol/L glucose+35 mmol/L mannitol..n=3.*P＜0.05 vs 5 mmol/L glucose.圖5 高糖對(duì)晚期EPCs增殖能力的影響

Figure 6.The effects of high glucose on the migration of late EPCs.1:5 mmol/L glucose;2:10 mmol/L glucose;3:20 mmol/L glucose;4:40 mmol/L glucose;5:5 mmol/L glucose+35 mmol/L mannitol..n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 5 mmol/L glucose.圖6 高糖對(duì)晚期EPCs遷移能力的影響

Figure 7.The effects of high glucose on the adhesion of late EPCs.1:5 mmol/L glucose;2:10 mmol/L glucose;3:20 mmol/L glucose;4:40 mmol/L glucose;5:5 mmol/L glucose+35 mmol/L mannitol..n=3.*P ＜0.05 vs 5 mmol/L glucose.圖7 高糖對(duì)晚期EPCs黏附能力的影響

3 高糖對(duì)EPCs分泌炎癥介質(zhì)MCP－1及IL－8的影響

晚期EPCs經(jīng)不同濃度的葡萄糖孵育后，10 mmol/L葡萄糖處理組其細(xì)胞培養(yǎng)上清中MCP－1及IL－8含量與正常葡萄糖處理組(5 mmol/L)相比無顯著差異(P＞0.05)。而在 20 mmol/L及40 mmol/L葡萄糖處理組，細(xì)胞上清中炎癥介質(zhì)MCP－1及IL－8的含量明顯高于正常葡萄糖處理組(P＜0.05)，而高滲透壓對(duì)照組與5 mmol/L葡萄糖組相比無顯著差異，見圖8、9。

Figure 8.The effects of high glucose on the secretion of MCP－1 in late EPCs.1:5 mmol/L glucose;2:10 mmol/L glucose;3:20 mmol/L glucose;4:40 mmol/L glucose;5:5 mmol/L glucose+35 mmol/L mannitol..n=4.*P ＜0.05 vs 5 mmol/L glucose.圖8 高糖對(duì)晚期EPCs分泌MCP－1的影響

Figure 9.The effects of high glucose on the secretion of IL－8 in late EPCs.1:5 mmol/L glucose;2:10 mmol/L glucose;3:20 mmol/L glucose;4:40 mmol/L glucose;5:5 mmol/L glucose+35 mmol/L mannitol..n=4.*P ＜0.05 vs 5 mmol/L glucose.圖9 高糖對(duì)晚期EPCs分泌IL－8的影響

討 論

隨著對(duì)EPCs研究的不斷深入，有學(xué)者指出:EPCs可分為早期EPCs及晚期EPCs。早期EPCs增殖能力有限、不能傳代培養(yǎng)，表達(dá) CD133、CD34、CD45等造血干細(xì)胞標(biāo)志，但內(nèi)皮細(xì)胞特異性的表面標(biāo)志表達(dá)不高。晚期EPCs增殖能力強(qiáng)，能傳代生長(zhǎng)大概12周左右且專一地表達(dá)一些內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，如 VEGFR －2、VE － cadherin、vWF 等［11］。一般認(rèn)為培養(yǎng)7 d內(nèi)的EPCs為早期EPCs，而能形成集落并可傳代培養(yǎng)的EPCs為晚期EPCs［12］。本研究結(jié)果顯示:傳至第3代的EPCs高表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性的表面標(biāo)志VEGFR－2、VE－cadherin、vWF等，但干細(xì)胞標(biāo)志CD133的表達(dá)量極低，提示后續(xù)實(shí)驗(yàn)所采用的靶細(xì)胞為晚期EPCs。

正常情況下，骨髓EPCs來源的內(nèi)皮細(xì)胞占所有新形成的內(nèi)皮細(xì)胞的25%［13－14］。但在糖尿病患者，EPCs數(shù)量減少、功能降低，然而其內(nèi)在機(jī)制尚不明晰。基于糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病。故有必要深入探討高糖對(duì)EPCs，特別是晚期EPCs功能的影響。本研究結(jié)果顯示:與正常葡萄糖組相比，高糖處理明顯抑制了晚期EPCs的增殖能力，這可能涉及到以下機(jī)制:(1)高糖可顯著促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，加速其衰老［15］;(2)高糖通過自由基攻擊膜蛋白及胞內(nèi)的核酸和酶系統(tǒng)，使細(xì)胞增殖率下降［16］。另外，在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，由于高糖的毒性作用，晚期EPCs的遷移、黏附能力亦受損，這必將影響受損血管的再內(nèi)皮化，在一定程度上影響著糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展［17］。

MCP－1及 IL－8是兩種重要的趨化蛋白。MCP－1是趨化因子CC家族的一個(gè)主要成員，而IL－8屬于趨化因子CXC家族，前者具有誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化及激活單核細(xì)胞的雙重功能，后者能夠吸引中性粒細(xì)胞，在動(dòng)脈粥樣斑塊中的表達(dá)量與新生血管的生成及巨噬細(xì)胞的聚集呈正相關(guān)［18］。有文獻(xiàn)證實(shí)高糖可促進(jìn)成熟內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1及IL－8表達(dá)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞向血管內(nèi)皮聚集，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮系統(tǒng)功能的損害，引起動(dòng)脈粥樣硬化等糖尿病血管并發(fā)癥［19－20］。另外，亦有文獻(xiàn)表明培養(yǎng)的EPCs，特別是晚期EPCs可合成、分泌MCP－1、IL－8等炎癥介質(zhì)［21］。本研究結(jié)果顯示:高糖可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞——EPCs合成、分泌MCP－1及IL－8，這一發(fā)現(xiàn)有助于解釋動(dòng)脈粥樣硬化等糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制及進(jìn)展過程。

在當(dāng)前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)高糖不僅抑制EPCs的增殖、遷移和黏附，還促進(jìn)MCP－1及IL－8的釋放。高糖的這種毒性作用可能是當(dāng)糖尿病患者血糖控制不良時(shí)，導(dǎo)致患者易發(fā)生血管病變及傷口不易愈合的重要原因。因此，糖尿病患者應(yīng)嚴(yán)格控制血糖，以改善EPCs的功能，從而保證對(duì)血管內(nèi)皮損傷及時(shí)修復(fù)，以防止糖尿病血管合并癥的發(fā)生和延緩其發(fā)展。

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