戴厚永，湯日寧，鄭 敏，倪 杰，馬坤嶺，劉必成△

(1東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇 南京 210009;2南通大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇 南通 226001)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見(jiàn)的慢性微血管并發(fā)癥之一，也是尿毒癥透析的主要病因。研究表明，足細(xì)胞在DN的進(jìn)展過(guò)程中起重要作用［1－2］。近年來(lái)研究顯示在高糖及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factorβ，TGF － β)等作用下，足細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelialmesenchymal transition，EMT)，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)屏障發(fā)生障礙引起蛋白尿［3－4］。已有大量證據(jù)表明結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)參與DN的發(fā)生和發(fā)展［5－6］，但有關(guān)其在糖尿病足細(xì)胞病變，尤其是EMT中的作用還不很清楚。本研究旨在探討CTGF在高糖環(huán)境下，足細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)所起的作用，為防治DN提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 足細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠永生系足細(xì)胞為美國(guó)阿爾伯特愛(ài)因斯坦醫(yī)學(xué)院Peter Mundel教授惠贈(zèng)，南京醫(yī)科大學(xué)張愛(ài)華教授轉(zhuǎn)贈(zèng)。培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)［7］:將復(fù)蘇的足細(xì)胞接種至涂有Ⅰ型膠原的25 cm2培養(yǎng)瓶，用含10% 胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基［添加重組小鼠γ干擾素(γ－interferon，γ －IFN)1×104U/L，Gibco］在 33℃條件下培養(yǎng)，隔天換液，此時(shí)足細(xì)胞處于未分化狀態(tài)，細(xì)胞增殖，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至85%左右融合時(shí)，予以0.25%胰蛋白酶消化傳代。誘導(dǎo)分化時(shí)，將未分化足細(xì)胞置于37℃條件下(不含γ－IFN)繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)10 d，即為分化成熟的足細(xì)胞，用分化好的足細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)分組

將在分化條件下的足細(xì)胞分為正常葡萄糖(glucose solution，GS)(5 mmol/L)培養(yǎng)組、正常葡萄糖+CTGF(重組人 CTGF 50 μg/L［8］，PeproTech)組、高糖(30 mmol/L)培養(yǎng)組和高糖+CTGF組，在37℃條件下刺激24 h。同時(shí)采用甘露醇作為滲透壓對(duì)照組(5 mmol/L葡萄糖+25mmol/L甘露醇)。根據(jù)是否加抗 CTGF抗體，進(jìn)一步分為正常葡萄糖培養(yǎng)組(5 mmol/L)、高糖培養(yǎng)組(30 mmol/L)和高糖+抗CTGF(10 mg/L，Santa Cruz，于葡萄糖刺激前2 h給予［9］)培養(yǎng)組，用于研究抗CTGF抗體對(duì)高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞的作用。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。

3 形態(tài)學(xué)觀(guān)察

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，從培養(yǎng)箱中取出足細(xì)胞，在超凈臺(tái)下，吸取培養(yǎng)瓶上清液，PBS清洗2次，更換新鮮培養(yǎng)液后，旋緊培養(yǎng)瓶，放置于倒置顯微鏡下，觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化，用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照。

4 實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR

用RNAiso Plus試劑(TaKaRa)提取腎皮質(zhì)總RNA，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將提取的RNA用SYBR ExScriptTMRT－PCR試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取2 μL cDNA加入前引物、后引物及SYBR預(yù)混液等共 20 μL體系在 ABI PRISM 7300PCR儀(Applied Biosystems)進(jìn)行擴(kuò)增。所需引物序列如下:

β－actin上游引物 5'－CCTCTATGCCAACACAGTGC －3'，下游引物 5'－GTACTCCTGCTTGCTGATCC－3';nephrin上游引物5'－CCCAGGTACACAGAGCACAA －3'，下游引物 5'－CTCACGCTCACAACCTTCAG－3';desmin上游引物5'－TGCAGCCACTCTAGCTCGTA －3'，下游引物 5'－GACATGTCCATCTCCACCTG － 3'。采用 2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA的含量。

5 Western blotting

細(xì)胞培養(yǎng)完畢，用PBS洗2遍，加適量裂解液用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞使其脫落裂解，后收集裂解液常規(guī)離心，取上清液檢測(cè)蛋白濃度。取20 μg蛋白變性后SDS－PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)入PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，0.3%TBST洗膜3次，分別加入羊抗nephrin和羊抗 desmin多克隆抗體(Santa Cruz，1∶200)，4℃過(guò)夜。TBST洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗兔抗山羊 IgG(Boster，1∶1000)室溫孵育 1 h，PBS洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。用β－actin作為內(nèi)參照，以目的蛋白與β－actin蛋白的灰度值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 CTGF在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞表型改變中的作用

正常培養(yǎng)條件下(5 mmol/L葡萄糖)，分化成熟的足細(xì)胞呈現(xiàn)上皮細(xì)胞的特點(diǎn)，顯微鏡下觀(guān)察到典型的“樹(shù)枝狀”改變，見(jiàn)圖1A。高糖環(huán)境下，足細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，呈現(xiàn)“鵝卵石”樣外觀(guān)，見(jiàn)圖1C。CTGF與高糖共同培養(yǎng)足細(xì)胞加劇其表型改變，細(xì)胞進(jìn)一步呈現(xiàn)梭形，胞體拉長(zhǎng)，見(jiàn)圖1D。然而CTGF與正常葡萄糖共同培養(yǎng)足細(xì)胞，未引起明顯形態(tài)學(xué)變化，見(jiàn)圖1B。

Figure 1.The morphology analysis of podocytes under different culture conditions(×200).A:podocytes cultured with 5 mmol/L GS;B:5 mmol/L GS supplemented with CTGF;C:30 mmol/L GS;D:30 mmol/L GS supplemented with CTGF.圖1 不同培養(yǎng)條件下足細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察結(jié)果

2 CTGF對(duì)高糖作用下足細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志物nephrin的作用

如圖2所示，與正常對(duì)照組相比，高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞nephrin mRNA和蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)。CTGF與高糖共同培養(yǎng)足細(xì)胞后nephrin表達(dá)進(jìn)一步減少，表明CTGF和高糖對(duì)足細(xì)胞的nephrin表達(dá)有協(xié)同作用(P＜0.05)。滲透壓對(duì)照組的nephrin mRNA和蛋白表達(dá)水平與正常葡萄糖培養(yǎng)組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

Figure 2.The effect of CTGF on nephrin expression in podocytes under different conditions.A:the result of real－ time RT － PCR;B:the Western blotting analysis.1:podocytes cultured with 5 mmol/L GS;2:5 mmol/L GS supplemented with CTGF(50 μg/L);3:30 mmol/L GS;4:30 mmol/L GS supplemented with CTGF;5:5 mmol/L GS supplemented with 25 mmol/L mannitol..n=3.#P ＜0.05 vs group 1;△P ＜0.05 vs group 3.圖2 CTGF對(duì)不同培養(yǎng)條件下足細(xì)胞nephrin表達(dá)的影響

3 CTGF對(duì)高糖作用下足細(xì)胞間充質(zhì)標(biāo)志物desmin的作用

Real－time RT－PCR檢查結(jié)果顯示，高糖(30 mmol/L)刺激足細(xì)胞24 h后，desmin mRNA表達(dá)水平較正常糖(5 mmol/L)培養(yǎng)增加約2.5倍(P＜0.05)，見(jiàn)圖3A，加入CTGF后，desmin mRNA表達(dá)進(jìn)一步增加(P＜0.05)。在蛋白水平檢測(cè)也得到與基因表達(dá)相類(lèi)似的結(jié)果，見(jiàn)圖3B。以上結(jié)果表明了外源性CTGF與高糖協(xié)同作用使足細(xì)胞間充質(zhì)標(biāo)志物desmin表達(dá)增加。

Figure 3.The effect of CTGF on desmin expression in podocytes under different conditions.A:the result of real－ time RT － PCR;B:the Western blotting analysis.1:podocytes cultured with 5 mmol/L GS;2:5 mmol/L GS supplemented with CTGF(50 μg/L);3:30 mmol/L GS;4:30 mmol/L GS supplemented with CTGF;5:5 mmol/L GS supplemented with 25 mmol/L mannitol..n=3.#P ＜0.05 vs group 1;△P ＜0.05 vs group 3.圖3 CTGF對(duì)不同培養(yǎng)條件下足細(xì)胞desmin表達(dá)的影響

4 CTGF對(duì)正常糖培養(yǎng)足細(xì)胞EMT有關(guān)指標(biāo)的影響

為了解正常培養(yǎng)情況下，CTGF對(duì)足細(xì)胞的表型改變以及EMT相關(guān)指標(biāo)有無(wú)影響，將CTGF與足細(xì)胞共同培養(yǎng)。與未加CTGF組相比，未發(fā)現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變，見(jiàn)圖1B。上皮細(xì)胞標(biāo)志物nephrin mRNA和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比未有明顯差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖2。間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物desmin檢測(cè)也獲得相同的結(jié)果(P＞0.05)，見(jiàn)圖3。以上結(jié)果表明正常糖(5 mmol/L)環(huán)境下，體外培養(yǎng)時(shí)CTGF不足以引起足細(xì)胞發(fā)生EMT。

5 阻斷CTGF對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT的影響

為進(jìn)一步研究CTGF在高糖引起的足細(xì)胞EMT中的作用，將抗CTGF抗體加入高糖培養(yǎng)基，與未加抗CTGF抗體培養(yǎng)組相比，其能部分逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞EMT，即部分足細(xì)胞又恢復(fù)上皮細(xì)胞樣變化，重新呈現(xiàn)“樹(shù)枝狀”，見(jiàn)圖4C。實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，抑制CTGF后desmin表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，而 nephrin表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，見(jiàn)圖 4D。Western blotting檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步支持了以上結(jié)果，見(jiàn)圖4E、F。以上結(jié)果顯示抑制CTGF能部分阻斷高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT過(guò)程。

Figure 4.Effects of anti－CTGF antibody on high glucose－induced EMT in podocytes(×200).The morphology of podocytes cultured with 5 mmol/L GS(A)，30 mmol/L GS(B)and 30 mmol/L GS supplemented with anti－CTGF antibody(C)was observed.D:the result of real－ time RT － PCR;E，F(xiàn):the Western blotting.β － actin was used as control.1:5 mmol/L GS;2:30 mmol/L GS;3:30 mmol/L GS supplemented with anti－CTGF antibody..n=3.#P＜0.05 vs group 1;△P＜0.05 vs group 2.圖4 抗CTGF抗體對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT的作用

討 論

近年來(lái)，足細(xì)胞損傷成為 DN研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［1－2，10］。在相關(guān)損傷因子作用下，足細(xì)胞損傷后會(huì)發(fā)生EMT，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物如nephrin、ZO－1和P－cadherin等表達(dá)下調(diào)，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物desmin、成纖維細(xì)胞特異性蛋白－1(fibroblast－specific protein－1，F(xiàn)SP－1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase－9，MMP－9)和 fibronectin等表達(dá)上調(diào)［3］。本研究以上皮細(xì)胞標(biāo)志物nephrin和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物desmin為觀(guān)測(cè)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)高糖本身能引起足細(xì)胞發(fā)生EMT，表現(xiàn)為nephrin減少，desmin增加;CTGF與高糖有協(xié)同作用，進(jìn)一步促進(jìn)EMT的發(fā)生。有趣的是，CTGF本身在正常糖環(huán)境下，并不導(dǎo)致足細(xì)胞發(fā)生EMT，而用抗CTGF抗體能阻斷高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT。

CTGF是CCN家族的重要成員，由4個(gè)功能模塊組成，是一重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成、細(xì)胞黏附、凋亡、傷口愈合、細(xì)胞外基質(zhì)的合成以及器官纖維化等多方面發(fā)揮重要作用［11］。研究顯示CTGF在DN中發(fā)揮重要作用。Ito等［12］最早利用原位雜交方法檢測(cè)DN患者腎組織，發(fā)現(xiàn)腎小球、腎小球毛細(xì)血管外區(qū)域、系膜增生區(qū)CTGF mRNA表達(dá)顯著增加，且與腎損傷程度呈正相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)阻斷CTGF能夠減輕DN蛋白尿，改善預(yù)后［13］。目前認(rèn)為CTGF是糖尿病腎損傷的重要生物標(biāo)志物和治療目標(biāo)［14－15］。我們體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗CTGF抗體能抑制足細(xì)胞EMT，表明抑制CTGF有足細(xì)胞保護(hù)作用。

Roestenberg等［16］發(fā)現(xiàn)，正常情況下腎組織 CTGF主要表達(dá)于足細(xì)胞和壁層上皮細(xì)胞，而系膜細(xì)胞表達(dá)較少;在DN時(shí)，CTGF最先在足細(xì)胞升高然后才是系膜細(xì)胞，顯示了CTGF與足細(xì)胞病變之間的關(guān)系。Yokoi等［17］將足細(xì)胞過(guò)度表達(dá)CTGF的轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)糖尿病后，發(fā)現(xiàn)其蛋白尿水平較未過(guò)表達(dá)CTGF的對(duì)照組糖尿病小鼠明顯增加，足細(xì)胞病變和系膜基質(zhì)擴(kuò)張也更加明顯，這一發(fā)現(xiàn)為CTGF在體內(nèi)引起足細(xì)胞損傷提供了直接證據(jù)。然而有趣的是，盡管轉(zhuǎn)基因小鼠腎小球CTGF蛋白表達(dá)水平是非轉(zhuǎn)基因小鼠的5倍，但此時(shí)腎組織結(jié)構(gòu)檢查卻正常，表明單純CTGF過(guò)度表達(dá)不足以致病。將CTGF基因轉(zhuǎn)染給其它組織細(xì)胞如肝、心和肺等也得到相類(lèi)似的結(jié)果，由此認(rèn)為CTGF在致纖維化病變過(guò)程中是起調(diào)節(jié)作用而不是直接致纖維化作用［18］。與此研究結(jié)果一致，我們用CTGF直接刺激足細(xì)胞未引起足細(xì)胞EMT也證實(shí)CTGF單獨(dú)作用有限。此外，我們發(fā)現(xiàn)CTGF與高糖有協(xié)同作用，促使足細(xì)胞EMT加劇，表明CTGF在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用。

總之，更好地理解高糖環(huán)境下足細(xì)胞CTGF的作用途徑和闡明其中的信號(hào)通路，能為更特異性地防治DN提供有力的武器。

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