朱安娜，李俊東，馮艷玲，徐漫漫，肖 娟

(1華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室，2中山大學(xué)腫瘤防治中心婦科，廣東 廣州 510060;3汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院婦科，廣東 汕頭 515000)

卵巢漿液性腺癌(ovarian serous adenocarcinoma)是卵巢上皮性癌最常見的亞型，易發(fā)生局部侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率波動于20% ～65%［1-2］。侵襲和轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為卵巢漿液性腺癌患者治療困難和預(yù)后差的重要原因之一。S100蛋白是由 Moore［3］1965年從牛腦組織中分離出的一種低分子量(10～12 kD)鈣離子結(jié)合蛋白，該蛋白家族具有共同的EF雙螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸序列，能與鈣離子結(jié)合導(dǎo)致S100蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，暴露與靶蛋白的結(jié)合位點，隨之與靶蛋白結(jié)合，在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)功能如細(xì)胞增殖分化、肌肉收縮、細(xì)胞周期調(diào)控、基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡等［4-5］。S100A4蛋白是S100蛋白家族成員之一，由101個氨基酸組成的多肽，分子量為11.5 kD。該蛋白被歸類于一種轉(zhuǎn)移促進(jìn)因子，具有促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力。本研究通過免疫組化方法檢測S100A4蛋白在卵巢漿液性腺癌中的表達(dá)情況，探討S100A4蛋白表達(dá)與卵巢漿液性腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其臨床意義。

材料和方法

1 研究對象

收集1999年11月～2006年3月在中山大學(xué)腫瘤防治中心接受手術(shù)治療的卵巢漿液性腺癌組織標(biāo)本共69例。入選的卵巢漿液性腺癌患者術(shù)前均未接受化療、放療和其它治療;且均在我院行卵巢癌全面分期手術(shù)或腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，術(shù)后病理明確診斷為卵巢漿液性腺癌;患者無合并身體其它器官腫瘤。入選患者均有5年隨訪資料，隨訪時間為8個月～130個月，其中31例死亡，38例生存。按2009年卵巢癌FIGO分期系統(tǒng)進(jìn)行分期，Ⅰa期4例，Ⅰc期9例，Ⅱa期4例，Ⅱb期7例，Ⅱc期5例，Ⅲa期1例，Ⅲb期4例，Ⅲc期32例，Ⅳ期3例。所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，常溫下保存。

選擇同期在我院首診的45例卵巢漿液性腺瘤和20例卵巢交界性漿液性腺瘤作為對照組。

卵巢癌復(fù)發(fā)的判斷標(biāo)準(zhǔn):CA125進(jìn)行性升高;體檢發(fā)現(xiàn)腫塊;影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腫塊;出現(xiàn)胸腹水;不明原因腸梗阻。出現(xiàn)上述中的2項視為復(fù)發(fā)。

2 主要試劑

S100A4兔抗人多克隆抗體購自Abcam，工作濃度為1∶200。通用型二步法檢測試劑盒，購自北京中杉-金橋生物技術(shù)有限公司，為非生物素兔二步法檢測試劑盒。

3 免疫組化方法及判定標(biāo)準(zhǔn)

采用免疫組化二步法，整個過程按試劑盒說明書進(jìn)行，用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。免疫組化結(jié)果判斷［6］:在光學(xué)顯微鏡下觀察組織標(biāo)本的陽性細(xì)胞比率及著色程度。高倍鏡下(放大200倍)隨機(jī)取4個不同的視野，計數(shù)細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)，按陽性細(xì)胞所占的百分比計分:陽性細(xì)胞率≤5%為0分;＞5%且≤25%為1分;＞25%且≤50%為2分;＞50%且≤75%為3分;＞75%為4分。同時，根據(jù)染色的強(qiáng)弱程度計分:無著色1分;淡黃色2分;黃色3分;深黃色4分。根據(jù)兩者的乘積來判斷結(jié)果:0分為(-);1～2分為(+);3～4分為(++);＞5分為(+++)。統(tǒng)計分析時(-)和(+)為低表達(dá)，(++)和(+++)為高表達(dá)。

4 隨訪

隨訪方式采取門診復(fù)查、電話和信件相結(jié)合，所有復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移病理均經(jīng)臨床、影像學(xué)或病理學(xué)證實。從手術(shù)之日起隨訪至死亡之日或隨訪終止日。隨訪終止日為2011年4月。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料用卡方檢驗或精確概率法檢驗;生存分析采用Kaplan-Meier法及l(fā)og-rank檢驗比較生存曲線的差異。用Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素回歸分析。以P＜0.05(雙側(cè)檢驗)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 S100A4蛋白在卵巢漿液性腺癌及各對照組中的表達(dá)

S100A4蛋白陽性表達(dá)的淺黃色至棕黃色顆粒見于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，見圖1。卵巢漿液性腺癌、卵巢交界性漿液性腺瘤和卵巢漿液性腺瘤組織中S100A蛋白的高表達(dá)率分別為78%、30%和27%，S100A4蛋白在卵巢漿液性腺癌組織中的高表達(dá)率顯著高于兩個對照組(P＜0.05)。而兩個對照組S100A4蛋白高表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

Figure 1.The expression of S100A4 protein in ovarian serous tumors(immunohistochemical staining，×200).A:ovarian serous adenoma;B:ovarian borderline serous adenoma;C:ovarian serous adenocarcinoma.圖1 S100A4蛋白在3種卵巢漿液性腫瘤組織中的表達(dá)

2 S100A4蛋白表達(dá)與卵巢漿液性腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

統(tǒng)計分析顯示，不同病理分級組S100A4蛋白高表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且隨著病理分級升高S100A4蛋白高表達(dá)率亦隨之升高。復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組S100A4蛋白高表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，復(fù)發(fā)組的S100A4蛋白高表達(dá)率高于未復(fù)發(fā)組。此外，未發(fā)現(xiàn)S100A4蛋白表達(dá)與卵巢漿液性腺癌患者的年齡、腫瘤直徑、術(shù)前血清CA125水平、FIGO分期相關(guān)(均P＞0.05)，見表1。

表1 S100A4蛋白高表達(dá)率與卵巢漿液性腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1.Correlation between the expression of protein S100A4 and clinicopathological characteristics of ovarian serous adenocarcinoma

3 卵巢漿液性腺癌患者的生存分析

單因素分析結(jié)果顯示患者無疾病進(jìn)展時間(progression-free survival，PFS)與病理分級(P ＜0.05)、FIGO分期(P＜0.01)、術(shù)后殘留病灶大小(以殘留病灶≤1 cm和殘留病灶＞1 cm為標(biāo)準(zhǔn)分2組)(P＜0.01)及S100A4蛋白表達(dá)(P=0.01)有關(guān);總生存時間(overall survival，OS)與術(shù)前血清CA125水平(P＜0.05)、病理分級(P＜0.01)、FIGO分期(P＜0.01)、術(shù)后殘留病灶大小(P＜0.01)及S100A4蛋白表達(dá)(P＞0.05)有關(guān)，生存曲線見圖2。多因素Cox比例風(fēng)險模型的預(yù)后分析結(jié)果顯示:術(shù)后殘留病灶大小(P＜0.01)和病理分級(P＜0.01)是影響卵巢漿液性腺癌預(yù)后的獨立因素，而S100A4蛋白表達(dá)(P＞0.05)不是影響卵巢漿液性腺癌預(yù)后的獨立因素。

討 論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特征，與細(xì)胞凋亡、新生血管形成［7］等密切相關(guān)。S100A4蛋白是S100蛋白家族成員之一，通過抑制細(xì)胞凋亡［8］、促進(jìn)血管生成［9-10］、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲能力［11］、調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動性［12］、降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)［13］、降低細(xì)胞粘附力［14］等機(jī)制促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。研究證實S100A4蛋白在人類多種惡性腫瘤如結(jié)腸癌［15］、胃癌［16］、腎癌［17］、胰腺癌［18］、膀胱癌［19］、甲狀腺癌［20］、黑色素瘤［21］、子宮內(nèi)膜癌［22］等表達(dá)，且其表達(dá)率與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、預(yù)后差有關(guān)，可作為一種預(yù)后標(biāo)志物及分子治療靶點，而通過對一些強(qiáng)表達(dá)S100A4的惡性腫瘤細(xì)胞系和荷瘤小鼠模型的研究證實，敲除S100A4基因可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力下降甚至消失［23］。已有文獻(xiàn)報道S100A4蛋白在卵巢漿液性腺癌組織的表達(dá)較卵巢良性腫瘤組織明顯增高，但尚未見S100A4蛋白與卵巢漿液性腺癌預(yù)后關(guān)系的進(jìn)一步研究。

Figure 2.Kaplan-Meier curves for the patients with ovarian serous carcinoma.A:progression-free survival;B:overall survival.圖2 卵巢漿液性腺癌患者S100A4低表達(dá)組和高表達(dá)組生存曲線圖

Kwak等［24］報道127例結(jié)直腸癌患者S100A4蛋白表達(dá)陽性率為35.4%，而在正常結(jié)直腸粘膜中S100A4蛋白表達(dá)缺乏。類似的結(jié)果在其它惡性腫瘤如乳腺癌［25］、膀胱癌［26］等亦觀察到。本研究中卵巢漿液性腺癌組S100A4蛋白高表達(dá)率為78%，明顯高于兩個對照組(卵巢漿液性腺瘤組和卵巢交界性漿液性腺瘤組)，而兩個對照組S100A4蛋白高表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示S100A4蛋白表達(dá)上調(diào)在卵巢漿液性腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起一定作用。

趙峻波等［27］發(fā)現(xiàn)S100A4蛋白在宮頸鱗癌中的表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Kwon等［28］對前列腺癌的研究發(fā)現(xiàn)S100A4蛋白高水平表達(dá)與前列腺癌組織的腫瘤分級有關(guān)。Kwak等［24］則發(fā)現(xiàn)S100A4蛋白陽性表達(dá)與結(jié)直腸癌的腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)。本研究中通過對S100A4蛋白高表達(dá)率與卵巢漿液性腺癌臨床病理特征關(guān)系的統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)S100A4蛋白高表達(dá)率與卵巢漿液性腺癌的病理分級有關(guān)，且隨著病理分級增高，S100A4蛋白高表達(dá)率亦隨之增高。一般而言，病理分級越高，癌細(xì)胞侵襲力越強(qiáng)，惡性度越高，更易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。從而推測病理分級高的卵巢漿液性腺癌細(xì)胞可能部分通過S100A4蛋白表達(dá)上調(diào)途徑增強(qiáng)其侵襲轉(zhuǎn)移能力，或者兩者在癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程可能發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，需進(jìn)一步研究證實。此外，研究也發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組的S100A4蛋白高表達(dá)率高于未復(fù)發(fā)組，可能與S100A4蛋白高表達(dá)的腫瘤更具侵襲力、更易發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示卵巢漿液性腺癌患者接受治療后，S100A4蛋白高表達(dá)的患者較S100A4蛋白低表達(dá)的患者，有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險，因而檢測S100A4蛋白的表達(dá)可以成為預(yù)測卵巢漿液性腺癌患者治療后復(fù)發(fā)風(fēng)險的因子之一。本研究中，未發(fā)現(xiàn)S100A4蛋白表達(dá)與患者術(shù)前CA125水平以及腫瘤直徑有關(guān)，推測術(shù)前CA125水平高低及腫瘤直徑大小與腫瘤的侵襲力可能不存在相關(guān)關(guān)系。

Kwak等［24］研究發(fā)現(xiàn) S100A4蛋白表達(dá)陽性與結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)、更差的總生存期相關(guān)。Mastumoto等［26］亦發(fā)現(xiàn)S100A4蛋白是膀胱癌治療結(jié)局的一個獨立預(yù)后因子。本研究對69例卵巢漿液性腺癌病例進(jìn)行生存分析，單因素分析發(fā)現(xiàn)患者無疾病進(jìn)展時間(PFS)與總生存時間(OS)均與S100A4蛋白表達(dá)有關(guān)?？梢园l(fā)現(xiàn)S100A4蛋白高表達(dá)是卵巢漿液性腺癌患者預(yù)后差的相關(guān)因素，可作為預(yù)測卵巢漿液性腺癌患者預(yù)后的因子。

多因素分析顯示手術(shù)后殘留病灶大小和病理分級是影響卵巢漿液性腺癌預(yù)后的獨立因素，提示病理分級相對于其它臨床病理因素對于卵巢漿液性腺癌患者的預(yù)后具有更大的影響。手術(shù)的徹底性對于患者的預(yù)后意義亦較大，故提倡手術(shù)治療卵巢漿液性腺癌患者時應(yīng)盡最大可能的切除病灶，盡量達(dá)到滿意減瘤。結(jié)果還顯示S100A4蛋白表達(dá)不是影響卵巢漿液性腺癌預(yù)后的獨立因素，是否與本組病例數(shù)不夠有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究證實。

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