孫 艷，黃莉霞，黃文浩，黃 斌

(廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

Sonic hedgehog(Shh)是刺猬因子(Hedgehog，Hh)家族的成員之一。該家族最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)，并證實(shí)與果蠅體節(jié)發(fā)育有關(guān)［1］。后來(lái)科學(xué)家在高等動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)3種Hh分子——Shh、India hedgehog(Ihh)和Desert hedgehog(Dhh)，并證實(shí)3種Hh分子經(jīng)過(guò)相同的信號(hào)通路［Patched(Ptch)/Smoothened(Smo)/glioma－ associated oncogene(Gli)］［2］在早期胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用。Shh是Hh家族中研究得最多也最為清楚的，它除了作為一種重要的成形素指導(dǎo)組織器官發(fā)育外［3］，還參與多種病理生理過(guò)程。研究顯示，Shh高表達(dá)或Shh信號(hào)異常活化是多種腫瘤細(xì)胞惡性增殖的機(jī)制之一［4］。與此同時(shí)，有研究報(bào)道Shh可以抑制CD3抗體刺激的外周T淋巴細(xì)胞活化［5］。因此，這類腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的Shh分子可能通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞功能參與其發(fā)病。本研究擬在體外外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)體系中應(yīng)用 Shh阻斷抗體阻斷Shh分子作用，并通過(guò)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞活化、功能性細(xì)胞因子分泌以及觀察PBMCs對(duì)HeLa的殺傷效果，初步探討Shh對(duì)PBMCs殺傷HeLa細(xì)胞功能的影響，為深入了解Shh信號(hào)與腫瘤免疫的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 細(xì)胞株和試劑

宮頸癌細(xì)胞株HeLa由廣東藥學(xué)院生物制藥研究所提供。Shh阻斷抗體、兔抗人IgG購(gòu)自Santa Cruz，RPMI－1640購(gòu)自Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自杭州四季青公司，CD3 PE－Cy5、CD69 FITC、CD71 FITC抗體購(gòu)自BD，免疫組織化學(xué)超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒購(gòu)自福州邁新公司，TaKaRa RNA PCR(AMV)kit購(gòu)自 TaKaRa，人 IFN － γ ELISA kit、人 IL－10 ELISA kit購(gòu)自達(dá)科為公司，人Ficoll－Hypaque淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊锕尽?/p>

2 方法

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Shh在HeLa細(xì)胞中的表達(dá) 消化收集HeLa細(xì)胞，以適當(dāng)密度接種于多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜。于第2 d棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定15 min。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)按試劑盒操作步驟進(jìn)行，包括:H2O2處理、血清封閉、Ⅰ抗(Shh抗體，1∶1000稀釋)孵育、生物素標(biāo)記的Ⅱ抗孵育、鏈霉親和素－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合、DAB顯色、脫水、封片。顯微鏡下觀察并拍照。取傳代多次的HeLa細(xì)胞，重復(fù)進(jìn)行以上檢測(cè)。

2.2 RT－PCR檢測(cè)Shh相關(guān)信號(hào)分子表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，Trizol法提取總RNA(按Trizol試劑說(shuō)明操作)，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。PCR擴(kuò)增 Gli1、Gli2、Gli3、Ptch1和Smo基因。擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)熱5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環(huán) 30次，72℃ 2 min。所用的引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Primer sequences

2.3 建立正常人PBMCs與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)體系消化收集HeLa細(xì)胞，按3×105/well接種于6孔板，37℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜。于第2 d采用PBMCs分離液分離正常人外周血PBMCs，調(diào)整細(xì)胞密度，按3×106/well接種于已有He-La細(xì)胞的6孔板，建立共培養(yǎng)體系。于共培養(yǎng)體系中加入Shh阻斷抗體使其終濃度為2 mg/L。設(shè)置對(duì)照組A(僅PBMCs培養(yǎng))以及對(duì)照組B(共培養(yǎng)體系加入兔抗人IgG抗體)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞活化 以上各組細(xì)胞培養(yǎng)16 h，消化收集細(xì)胞，PBS洗滌2次。加入CD3－PE－CY5、CD69－FITC和CD71－FITC抗體避光孵育25 min，洗滌1次，1%多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5 ELISA法檢測(cè)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平 于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，收集以上各組上清，按試劑盒操作步驟進(jìn)行ELISA檢測(cè)。主要實(shí)驗(yàn)步驟包括:加樣、抗體孵育2 h、洗板3次、加酶孵育20 min、洗板3次、顯色10 min、終止顯色10 min、酶標(biāo)儀讀取450 nm波長(zhǎng)處吸光度A值。同時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后按以上步驟檢測(cè)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品A值計(jì)算樣品濃度。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 HeLa細(xì)胞表達(dá)Shh及其信號(hào)分子

免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Shh在HeLa細(xì)胞的表達(dá)結(jié)果顯示，Shh在90%以上的HeLa細(xì)胞胞漿或胞核中呈陽(yáng)性表達(dá)，尤其在圓形、橢圓形HeLa細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見圖1A。將HeLa細(xì)胞傳代多次后再次進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示:HeLa細(xì)胞傳代6次，Shh表達(dá)水平?jīng)]有顯著改變，見圖1B。

Figure 1.Expression of Shh in HeLa cells in vitro(×200).A:Shh was expressed in the first passage of HeLa cells in vitro;B:Shh was expressed in the sixth passage of He-La cells in vitro.圖1 Shh在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)

RT－PCR法檢測(cè)Shh信號(hào)分子在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果顯示，Shh信號(hào)受體Ptch1、Smo以及轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Gli2、Gli3均在HeLa細(xì)胞中表達(dá)，見圖2。

Figure 2.Shh signaling molecules were expressed in HeLa cells.圖2 Shh信號(hào)分子在HeLa細(xì)胞中表達(dá)

2 Shh阻斷抗體促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞活化的結(jié)果顯示:(1)培養(yǎng)16 h，對(duì)照組A CD3+細(xì)胞(T細(xì)胞)數(shù)較少;對(duì)照組B和實(shí)驗(yàn)組CD3+細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組A顯著增多，見圖3A。(2)培養(yǎng)16 h，對(duì)照組A和B均未見CD69+細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組則出現(xiàn)較多 CD69+細(xì)胞(12.73% ±0.57%)，見圖3B。實(shí)驗(yàn)組 CD69+細(xì)胞與對(duì)照組B比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見圖3D。(3)培養(yǎng)36 h，實(shí)驗(yàn)組CD71+細(xì)胞為(10.83±2.51)%，而對(duì)照組A和對(duì)照組B CD71+細(xì)胞均處于較低水平，見圖3C。實(shí)驗(yàn)組CD71+細(xì)胞與對(duì)照組B相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見圖3D。

3 Shh阻斷抗體促進(jìn)細(xì)胞因子IFN－γ的分泌，但抑制IL－10的分泌

ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子分泌的結(jié)果顯示:(1)對(duì)照組A上清中IFN－γ水平在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后均保持在較低水平;而對(duì)照組B及實(shí)驗(yàn)組上清中IFN－γ水平隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高。Shh阻斷抗體作用24 h、48 h、72 h，共培養(yǎng)體系上清中IFN－γ水平較對(duì)照組A及對(duì)照組B顯著增高，是對(duì)照組B的1.5～2倍，見圖4。(2)對(duì)照組A上清中IL－10水平在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h均保持在較低水平;而對(duì)照組B及實(shí)驗(yàn)組上清中IL－10水平均較對(duì)照組A有顯著升高。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，實(shí)驗(yàn)組上清中IL－10水平均較對(duì)照組B顯著下降，見圖5。(3)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組 A、對(duì)照組 B 的培養(yǎng)上清中IL－4均維持在很低水平(＜10 ng/L)。

4 Shh阻斷抗體促進(jìn)PBMCs對(duì)HeLa細(xì)胞的殺傷

形態(tài)學(xué)觀察顯示，Shh阻斷抗體作用12 h，實(shí)驗(yàn)組HeLa細(xì)胞形態(tài)已開始發(fā)生變化，部分HeLa細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙可見細(xì)胞碎片，見圖6B;培養(yǎng)48 h，He-La細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞碎片增多，見圖6D;培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)體系中大部分HeLa細(xì)胞已死亡，可見較多細(xì)胞碎片，見圖6F。而未加Shh阻斷抗體的共培養(yǎng)體系培養(yǎng)12 h，HeLa細(xì)胞未見明顯的形態(tài)學(xué)改變，見圖6A;培養(yǎng)48 h，HeLa細(xì)胞才開始出現(xiàn)形態(tài)變化，部分細(xì)胞變圓，培養(yǎng)體系中可見細(xì)胞碎片，但大部分HeLa細(xì)胞仍為短梭形，見圖6C;培養(yǎng)72 h，共培養(yǎng)體系中仍可見較多形態(tài)正常的HeLa細(xì)胞，見圖6E。

討 論

研究顯示，Shh在腫瘤中高表達(dá)或Shh信號(hào)異?；罨瘜?dǎo)致多種腫瘤，包括宮頸癌［6］的惡性增殖。但Shh是否也在體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞中表達(dá)，目前尚未見報(bào)道。本研究因此首先檢測(cè)了HeLa細(xì)胞中Shh表達(dá)水平，結(jié)果表明Shh在90%以上的HeLa細(xì)胞中均有陽(yáng)性表達(dá)，而且部分HeLa細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。而鑒于Sasai等［7］曾報(bào)道體外培養(yǎng)的髓母細(xì)胞瘤Shh表達(dá)會(huì)嚴(yán)重下降，我們對(duì)傳代多次的HeLa細(xì)胞進(jìn)行了重復(fù)檢測(cè)。結(jié)果顯示，HeLa細(xì)胞體外傳代6次，Shh表達(dá)水平仍未發(fā)生顯著改變，說(shuō)明Shh的表達(dá)不會(huì)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)及傳代次數(shù)增多而下降。采用RT－PCR法檢測(cè)Shh信號(hào)分子，結(jié)果顯示HeLa細(xì)胞表達(dá)所有Shh信號(hào)通路分子，包括跨膜受體Ptch1、Smo蛋白以及Shh信號(hào)活化的轉(zhuǎn)錄因子 Gli1、Gli2、Gli3，提示 HeLa細(xì)胞自分泌Shh分子激活Shh信號(hào)通路，進(jìn)一步證實(shí)Shh在He-La細(xì)胞中表達(dá)。

Figure 3.Anti－Shh blocking antibody promoted activation of PBMCs.A:CD3+cells significantly increased in co－cultured system at 16 h;B:CD69+cells increased in co－cultured system with 2 mg/L anti－Shh blocking antibody at 16 h;C:CD71+cells increased in co－cultured system with 2 mg/L anti－Shh blocking antibody at 36 h;D:Bar graph showed the expression of CD3，CD69 and CD71..n=3.▲▲P＜0.01 vs PBMCs;＊＊P＜0.01 vs PBMCs+HeLa.圖3 Shh阻斷抗體促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化

Figure 4.Anti－Shh blocking antibody increased the secretion of IFN－γ..n=3.＊＊P＜0.01 vs PBMCs+HeLa.圖4 Shh阻斷抗體促進(jìn)IFN－γ的分泌

Figure 5.Anti－Shh antibody inhibited the secretion of IL－10..n=3.＊＊P＜0.01 vs PBMCs+HeLa.圖5 Shh阻斷抗體抑制IL－10的分泌

Figure 6.Anti－Shh antibody promoted PBMCs to kill HeLa cells(×400).A:PBMCs+HeLa(12 h);B:PBMCs+HeLa+Shh Ab(12 h);C:PBMCs+HeLa(48 h);D:PBMCs+HeLa+Shh Ab(48 h);E:PBMCs+HeLa(72 h);F:PBMCs+HeLa+Shh Ab(72 h).White arrow:PBMCs.圖6 Shh阻斷抗體增強(qiáng)PBMCs殺傷HeLa細(xì)胞的作用

我們進(jìn)而采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離正常人PBMCs，并與HeLa細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系。由于PBMCs主要是淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，包含了抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞［8－9］，因此可以在體外反映抗腫瘤功能。首先采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞表達(dá)CD3、CD69和CD71分子的情況。結(jié)果顯示:與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)16h，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組B CD3+細(xì)胞數(shù)目均顯著增加，達(dá)到無(wú)腫瘤細(xì)胞組的10倍左右。由于CD3主要表達(dá)于成熟T淋巴細(xì)胞和NK T細(xì)胞表面，是T淋巴細(xì)胞特異性表面標(biāo)記，同時(shí)也是參與傳遞T淋巴細(xì)胞活化第一信號(hào)的重要分子［10］，因此CD3+細(xì)胞數(shù)增加表明在腫瘤細(xì)胞刺激下T淋巴細(xì)胞出現(xiàn)大量增殖。進(jìn)一步檢測(cè)淋巴細(xì)胞早期活化標(biāo)記CD69分子和活化標(biāo)記CD71分子［11］，結(jié)果顯示:培養(yǎng)16 h，Shh阻斷抗體處理的共培養(yǎng)體系中出現(xiàn)12.7%的 CD69+細(xì)胞，而沒有Shh抗體作用的對(duì)照組B和單純PBMCs組均未出現(xiàn)CD69+細(xì)胞，提示Shh阻斷抗體可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞早期活化。培養(yǎng)36 h，Shh阻斷抗體處理組出現(xiàn)10%左右的CD71+細(xì)胞，而對(duì)照組B和對(duì)照組A均未見CD71+細(xì)胞，提示Shh阻斷抗體進(jìn)一步促進(jìn)淋巴細(xì)胞發(fā)生晚期活化。

淋巴細(xì)胞活化后會(huì)改變功能性細(xì)胞因子表達(dá)譜以完成相關(guān)的生物學(xué)功能［12］，因此細(xì)胞因子分泌種類和數(shù)量的改變也可以間接反映淋巴細(xì)胞功能狀態(tài)。采用ELISA法檢測(cè)淋巴細(xì)胞活化相關(guān)的細(xì)胞因子，結(jié)果顯示:在腫瘤細(xì)胞刺激下，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組B IFN－γ和IL－10的分泌增加，而IL－4的分泌在腫瘤抗原刺激與否的情況下都處于很低水平，說(shuō)明IFN－γ和IL－10參與了PBMCs抗HeLa細(xì)胞作用。研究結(jié)果還顯示，Shh阻斷抗體可以使IFN－γ分泌水平增加，但使IL－10分泌水平下降。由于IFN－γ是細(xì)胞免疫應(yīng)答重要的功能因子［13］，具有較好的抗病毒、抗腫瘤作用［14］，而IL－10則具有抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答的功能［15］，提示Shh阻斷抗體可以增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。此外，形態(tài)學(xué)觀察顯示，實(shí)驗(yàn)組He-La細(xì)胞被殺傷得更快，說(shuō)明Shh阻斷抗體可以促進(jìn)PBMCs殺傷HeLa細(xì)胞。

綜上所述，Shh阻斷抗體可以促進(jìn)PBMCs活化、分泌功能性細(xì)胞因子IFN－γ以及殺傷HeLa細(xì)胞效果，但抑制PBMCs分泌具有抑制細(xì)胞免疫功能的細(xì)胞因子IL－10，說(shuō)明Shh阻斷抗體可以增強(qiáng)PBMCs抗宮頸癌HeLa細(xì)胞的作用。而Shh是否參與了宮頸癌發(fā)病的免疫機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究和證實(shí)。

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