魏海龍，賀 亮,2*，甘慶軍，胡傳久,2，吳學謙,2，程俊文,2，李海波，付立忠,2

（1. 浙江省林業(yè)科學研究院，浙江省森林資源生物與化學利用重點實驗室，浙江 杭州 310023；2. 麗水市食用菌研究開發(fā)中心，浙江 麗水 323000；3. 慶元縣食用菌科研中心，浙江 慶元 323800）

茯苓來源于多孔菌科真菌茯苓（Poria cocos）的菌核，具有利尿、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤、增強免疫等藥效，屬藥食兩用的大宗藥材[1]，目前茯苓全國年需用量達17000 t左右。近年已報道，茯苓中提取的茯苓多糖或茯苓異多糖具有促進細胞分裂、補體激活、抗誘變、抗腫瘤、抗癌、增強免疫性等生物活性[2]。Narui等報道從茯苓菌絲體中分離出的多糖與天然菌核中的多糖結(jié)構(gòu)幾乎相同，主要為β-(1→3)-D-葡聚糖，帶少量支鏈[3]。用液體發(fā)酵培養(yǎng)及分離提取等新技術(shù)來生產(chǎn)茯苓，可連續(xù)地、大規(guī)模地進行工業(yè)化生產(chǎn)，大大縮短生產(chǎn)時間，并可節(jié)省大量的木材，對我國資源和生物多樣性的保護有著重要的意義。茯苓的液體發(fā)酵正逐漸成為研究的熱點。發(fā)酵茯苓菌絲體與野生或人工種植的天然茯苓（干燥菌核）所含活性成分有所差別，因此，應(yīng)將茯苓發(fā)酵菌絲體視為一種新型的發(fā)酵中藥。多糖是茯苓的主要活性成分，本文以發(fā)酵茯苓菌絲體和天然茯苓為材料，探討了茯苓多糖的提取分離工藝，并分別對二者總多糖的提取率及總糖的平均含量進行了測定，為茯苓相關(guān)保健食品和藥品的開發(fā)打下基礎(chǔ)[4]。

色譜分離技術(shù)已成為最主要最有效的分離純化技術(shù)之一。在傳統(tǒng)的軸向色譜分離過程中，隨著色譜柱直徑或柱長的增加，原來的色譜優(yōu)化條件往往不適宜，特別是進一步放大較高倍數(shù)時，結(jié)果更不能令人滿意[5]。對于大規(guī)模生物樣品的制備，迫切需要發(fā)展新型色譜技術(shù)。徑向流色譜法是近十年來發(fā)展起來的一種新型色偶分離技術(shù)，其獨特的徑向流動設(shè)計，可提高流速，降低柱壓，便于線性放大，在血液制品、基因工程產(chǎn)品、生物藥品和農(nóng)產(chǎn)品等的分離純化中已得到廣泛應(yīng)用[6]。

本文針對茯苓菌絲體的物料特性，采用徑向色譜分離技術(shù)，對茯苓菌絲體多糖進行快速分離，通過考察影響其分離效率的因素樣品濃度、上樣量、上樣流速、洗脫流速等，確定主要影響因子，同時結(jié)合響應(yīng)面工藝優(yōu)化法，把正交實驗設(shè)計和回歸分析有機的結(jié)合在一起，它可以在因素的試驗范圍內(nèi)選擇適當?shù)脑囼烖c，用較少的試驗建立一個精度高、統(tǒng)計性質(zhì)好的回歸方程，通過解回歸方程可求得茯苓菌絲體多糖分離最佳工藝條件，從而為茯苓菌絲體多糖的快速分離提供了工業(yè)化的前景。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

茯苓菌絲體粗多糖由浙江益圣發(fā)展有限公司提供；DEAE-Sepharose FF，購自 sigma公司；Superflo-50mL徑向色譜分離柱購自美國sephagen公司；Tris，葡萄糖、苯酚、硫酸、95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

臺式離心機，thermo fisher公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6，國華電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠；UV-9100紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；BS224S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；pHS-3C精密pH計，上海雷磁儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 多糖含量的測定 采用苯酚—硫酸法測定多糖含量[7]。

標準葡萄糖溶液：準確稱取0.1 g經(jīng)過105℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖（AR），加水溶解后以水稀釋至100 mL，此溶液1 mL含1 mg葡萄糖，用時從中吸取10 mL，用蒸餾水定容至250 mL，這時葡萄糖標準溶液的濃度記為C（約40 μg/mL左右）。

精密移取葡萄糖標準溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以水補至2.0 mL，用旋渦混勻器振勻，然后加入6%苯酚1.0 mL，用旋渦混勻器振勻，再加5 mL濃硫酸，迅速振勻。室溫放置5 min，然后在沸水浴中保溫15 min，用自來水冷卻5 min，再用旋渦混勻器振勻，于490 nm測光密度，以2.0 mL水按同樣顯色操作作為空白，以葡萄糖溶液濃度（μg/mL）為橫坐標，以吸光度（Abs）為縱坐標，得標準曲線。

樣品含量測定：吸取樣品液1.0 mL，按上述步驟操作，測定OD值，以標準曲線回歸方程Y= 0.0166X＋0.01計算多糖含量。其中X為葡萄糖濃度（μg/mL），Y為吸光值A(chǔ)，R2= 0.9947，說明線性關(guān)系良好。

1.2.2 茯苓菌絲體多糖的徑向流色譜分離 填料的灌裝：先將50 mL蒸餾水以25 mL/min流速沖入Superflo-50 mL徑向色譜柱，再將50 mL脫氣處理后的DEAE-Sepharose FF填料以5 mL/min用蠕動泵輸入到Superflo-50 mL徑向色譜分離柱內(nèi)，然后將徑向柱顛倒，用蒸餾水以10 mL/min流速沖填料，最后再用蒸餾水以20 mL/min流速正反平衡填料，直到填料裝填均勻。取適量稱質(zhì)量后的多糖樣品溶于蒸餾水中，以優(yōu)化的流速上樣，然后用蒸餾水按一定的流速洗脫，直至最后的洗脫液在490 nm處基本無吸收峰。將所得多糖分離液用去離子水透析，冷凍干燥機凍干稱質(zhì)量。待整個分離過程完成后，用1.5 mL/min NaCl溶液沖洗徑向柱，直至280 nm處無蛋白吸收峰，再用蒸餾水洗脫平衡。

1.2.3 分離條件的研究

1.2.3.1 茯苓菌絲體多糖徑向流色譜分離的響應(yīng)面分析試驗[2]為了優(yōu)化茯苓菌絲體多糖徑向分離工藝條件，根據(jù)Box-Behnken組合試驗設(shè)計原理，通過對樣品濃度、上樣量、上樣流速、洗脫流速的單因素試驗考察，選取對茯苓菌絲體多糖分離多糖回收率影響顯著的3個因素：上樣量（5、20、35 mL）、上樣流速（2、10、18 mL/min）、洗脫流速（5、20、35 mL/min），分別以X1、X2、X3代表，每一個自變量的低、中、高實驗水平分別以－1、0、1進行編碼，試驗設(shè)計如表1所示[6]。

1.2.4 多糖回收率的計算 茯苓菌絲體多糖回收率Y（%）=Y1/Y2×100%。其中Y1是茯苓菌絲體分離純化后的多糖重量；Y2為茯苓菌絲體粗多糖重量。

1.2.5 徑向流色譜分離與傳統(tǒng)方法的比較 本實驗的傳統(tǒng)軸向色譜分離采用玻璃分離柱（50 mL，2.6 cm×10 cm，上海滬西分析儀器廠），洗脫方法和徑向色譜分離條件相同；傳統(tǒng)化學方法為先用seveg法對一定量的茯苓菌絲體粗多糖脫出蛋白質(zhì)，反復4 ～ 5次，再用30%雙氧水除去色素，去離子水透析后，冷凍干燥稱質(zhì)量。最后計算每種方法的多糖回收率。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平表Table 1 Factors and levels of RSM analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 2 Experiment design and results of RSM

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果 響應(yīng)面分析實驗結(jié)果見表2、表3。

利用Design Expert7.0軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進行分析[7]，獲得茯苓菌絲體多糖回收率對上樣量、上樣流速和洗脫流速的多元二次回歸方程：

顯著性檢驗表明，模型回歸達到極顯著水平（表3），模型的決定系數(shù)R2= 0.9791，說明模型與實際實驗擬合有97.91%的符合度；校正決定系數(shù)Adj R2= 0.9523，說明該模型能解釋95.23%響應(yīng)值的變化；失擬項P值0.0030，說明檢驗結(jié)果與模型計算結(jié)果沒有顯著差異；若模型很好地預測了實驗結(jié)果，則F檢驗值應(yīng)遠遠大于理論計算值，從方差分析表知，模型F檢驗值為36.46，理論值在0.05水平上查表可得F（9,5）= 4.48，說明方程顯著性很高。在α為 0.05 水平上，X1、X2、X3、X1X2、X2X3、X1X1、X2X2、X3X3對響應(yīng)值的影響顯著，X1和X2交互間影響顯著，可用上述回歸方程描述各因子與響應(yīng)值的關(guān)系對不同分離條件下茯苓菌絲體多糖回收率進行分析和預測。

對模型回歸系數(shù)進行顯著性檢驗，結(jié)果見表3。從表3可以看出，在α= 0.05水平上，上樣流速的線性效應(yīng)極顯著，上樣量和上樣流速的線性效應(yīng)不顯著；上樣量和上樣流速及上樣流速與洗脫流速交互作用顯著；三個因素的一次、二次曲面效應(yīng)均顯著（P ＜ 0.01）。

2.2.2 響應(yīng)面圖形分析 分別將模型中的上樣量、上樣流速及洗脫流速的其中一個因素固定在0水平，得到另外兩個因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖1至圖3所示，各個因素及其相互間的交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果通過該組圖可以直觀地反映出來。極值條件應(yīng)該在等高線的圓心處。由幾組圖可以看出，影響茯苓菌絲體多糖徑向流色譜分離的最顯著的因素為上樣量流速（X2），表現(xiàn)為響應(yīng)面變化弧度較大；上樣量（X1）和洗脫流速（X3）響應(yīng)面弧度變化平緩，說明對響應(yīng)值影響相對較小。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA regression model

此外，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。從圖1至圖3可以看出，X1與X3交互作用顯著；X2與X3，X1與X2均無交互作用，表明一因素對響應(yīng)值的影響規(guī)律并不會隨著另一因素的改變而有明顯變化。

圖1 上樣量和上樣流速交互影響茯苓菌絲體多糖徑向色譜分離的曲面圖和等高線圖Figure 1 Response surface and contour for yield recovery as a function of sample volume and sample flow-rate at elution flow-rate 22 mL/min

圖2 上樣量和洗脫流速交互影響茯苓菌絲體多糖徑向色譜分離的曲面圖和等高線圖Figure 2 Response surface and contour for yield recovery as a function of sample volume and elution flow-rate at sample flow-rate 15 mL/min

圖3 上樣流速和洗脫流速交互影響茯苓菌絲體多糖徑向色譜分離的曲面圖和等高線圖Figure 3 Response surface and contour for yield recovery as a function of sample flow-rate and elution flow-rate at sample volume 25 mL

2.2.3 驗證實驗 通過Design-expert軟件對上述方程進行求解，得到最佳提取條件為：上樣量39.01 mL，上樣流速25.00 mL/min，洗脫流速33.00 mL/min。在此條件下，茯苓菌絲體多糖回收得率理論值可達84.12%。為檢驗該法的可靠性，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝參數(shù)修正為：當樣品濃度為8 mg/mL，上樣量為40 mL，上樣流速為25 mL/min，洗脫流速為33 mL/min時進行徑向流色譜分離茯苓菌絲體多糖的驗證試驗，經(jīng)3次平行試驗，實際多糖回收率為 83.43%、83.71%、82.65%，實際多糖回收率平均值為 83.26%，與回歸模型預測的回收率理論值無顯著差異，實驗結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預測茯苓菌絲體多糖回收率。

2.4 徑向流色譜分離與傳統(tǒng)方法的比較

當茯苓菌絲體多糖濃度為8 mg/mL，同樣上樣量為30 mL時，徑向色譜分離只需25 min即可完成整個過程，且多糖回收率高達83.32%，而傳統(tǒng)軸向色譜分離需耗時135 min，且多糖回收率下降4.75百分點；化學方法更加耗時，且多糖回收率在分離過程中大大下降，損失較多，具體結(jié)果見表4。

表4 徑向流色譜分離與傳統(tǒng)方法的比較結(jié)果Table 4 Comparison of RFC with AFC and chemical method

3 結(jié)論

將徑向流色譜分離技術(shù)應(yīng)用于茯苓菌絲體多糖中，并用響面分析法優(yōu)化分離工藝，采用合理的實驗設(shè)計，依據(jù)回歸分析確定各因素對多糖回收率的影響，取得了比較好的結(jié)果[8～10]。經(jīng)優(yōu)化后確定徑向流色譜分離茯苓菌絲體多糖的最佳工藝條件為：當樣品濃度為8 mg/mL，上樣量為40 mL，上樣流速為25 mL/min，洗脫流速為33 mL/min時，多糖回收率達到83.26%，比傳統(tǒng)軸向分離和化學方法更縮短時間，從而為茯苓菌絲體多糖的工業(yè)化開發(fā)和應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

[1]費榮昌. 實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理（第四版）[M]. 無錫：江南大學出版社，2001. 59－63.

[2]沈雅琴，張明發(fā)，朱自評，等. 茯苓菌絲體皮的鎮(zhèn)痛抗炎和抗血栓形成作用[J]. 藥物研究，1998，7（10）：30－31.

[3]韓莉，萬福珠，劉朝奇. 茯苓菌絲體果浸出液對荷瘤小鼠及其感染白色念珠菌的影響[J]. 咸陽醫(yī)學院，1999，13（3）：149－151.

[4]鄭麗紅，陳冠敏，林鴻，等. 微波輔助水提取茯苓多糖的安全性研究[J]. 海峽藥學，2010，22（10）：17－20.

[5]方圓，王雪彥，晁若冰. 土茯苓藥材中落新婦苷和總黃酮的含量測定方法研究[J]. 藥物分析雜志，2010（9）：1738－1741.

[6]楊丹，程忠泉，劉玉清，等. 茯苓皮的化學成分研究[J]. 安徽農(nóng)學通報，2010，16（19）：45－46.

[7]張越非，甘琳，池汝安，等. 離子液體微波輔助提取土茯苓中黃酮的研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2010，21（8）：1975－1977.

[8]姜慧燕，邵平，孫培龍，等. 徑向流色譜分離技術(shù)原理及應(yīng)用分析[J]. 核農(nóng)學報，2009，23（1）：118－122.

[9]龔志華，鄧燕莉，陳芳，等. 植物復合酶SPE-002提取茯苓多糖工藝研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學學報，2010，36（5）：565－568.

[10]陶躍中，姜輝，舒志愚，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化茯苓菌絲體多糖的提取工藝研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2010（17）：9095－9097.