楊 揚 吳衛(wèi)平 田書娟 武 雷 黃德暉 (中國人民解放軍總醫(yī)院神經內科,北京100850)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)是免疫介導的中樞神經系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)炎性脫髓鞘疾病,其主要病理表現(xiàn)為廣泛的炎性脫髓鞘過程,包括炎癥細胞浸潤、髓鞘脫失、軸索破壞、膠質細胞的活化與增生及纖維蛋白沉積等。目前,無論采用基因敲除還是藥物干預的方法,降低纖維蛋白沉積均可改善神經系統(tǒng)炎性反應和臨床癥狀[1,2]。降纖治療在MS的治療中尚未見報道。動物實驗證明,使用基因敲除或藥物干預方法去除纖維蛋白沉積可使實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)動物的發(fā)病延遲、臨床癥狀改善[3-5]。

巴曲酶是一種從蛇毒中提取和純化的類凝血酶,具有降解纖維蛋白原的作用,其在血栓性疾病的治療中已被廣泛應用。越來越多的證據(jù)表明,纖維蛋白在炎癥反應和自身防御中也起著重要作用。1996年,日本學者在細胞轉染和病毒誘導的EAE動物模型中應用巴曲酶后,脊髓血管周圍的纖維蛋白沉積明顯減少,血漿纖維蛋白原濃度降低。同時,預防性地注射巴曲酶可明顯減輕臨床癥狀,延緩發(fā)病及降低臨床評分[6,7]。然而,巴曲酶的降纖作用在髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(MOG)誘導的EAE動物模型中是否也具有治療作用仍不清楚。我們應用MOG誘導的EAE小鼠模型,觀察巴曲酶對小鼠的臨床癥狀、炎性細胞浸潤、髓鞘脫失及膠質細胞活化等改善情況,進一步探討纖維蛋白沉積在EAE發(fā)病機制中的作用,為臨床應用巴曲酶治療MS提供一種更有前景的新療法和新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 采用清潔級10～12周齡C57BL/6雌性小鼠(由我院動物中心提供),使用隨機表法隨機分為空白對照組(8只)、EAE對照組(12只)、巴曲酶預防用藥組(8只)和治療組(8只),飼養(yǎng)于無特殊病原體的清潔飼養(yǎng)室。

1.2 EAE模型的建立 以300μgMOG35-55多肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)溶入 200μl PBS溶液,再加入福氏佐劑(CFA)200 μl,添加10 mg/ml結核桿菌凍干粉,冰浴下充分攪拌10～20分鐘充分乳化,取小鼠雙側腹壁腹腔內注射,對照組則直接將200μl PBS液與200μl CFA乳化后注射。免疫后0及48小時腹腔內注射150μl百日咳毒素(2μg/ml)。正常對照組則直接將200μl PBS液與200μl CFA乳化后注射。免疫后隔天對小鼠稱重,我們實驗中按下列標準進行神經功能評分:0分,不發(fā)病;1分,尾部張力降低或輕度步態(tài)笨拙;2分,輕度后肢力弱;3分,后肢明顯力弱;4分,后肢癱瘓;5分,后肢癱瘓合并前肢力弱或瀕死狀態(tài)。

1.3 組織病理學觀察 10%水合氯醛0.2 ml麻醉各組小鼠,生理鹽水心臟灌注,4%多聚甲醛(PFA)灌注,冰上快速取出小鼠腰膨大部分脊髓及小腦。一部分在PFA中固定,用于石蠟包埋,組織切片機取6μm厚度連續(xù)切片;另一部分置30%蔗糖中4℃過夜,用于冰凍包埋后冰凍切片機10μm連續(xù)切片。每組石蠟切片用于常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)、Luxol快藍(LFB)染色,快速銀染和免疫組織化學染色,冰凍切片用于免疫熒光染色,光學顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察結果,并進行量化分析:(1)炎性浸潤評分:0分,無炎性浸潤;1分,少許炎癥細胞軟膜下浸潤;2分,血管周圍炎細胞浸潤;3分,血管周圍套袖樣炎細胞浸潤但未達到實質;4分,大范圍白質內炎細胞浸潤已達中心白質的1/4～1/2;5分,廣泛炎細胞浸潤達中心白質的1/2以上。(2)脫髓鞘評分:0分,無脫髓鞘;1分,少許軟膜下纖維脫髓鞘;2分,軟膜下部分邊緣受累但未達到實質;3分,廣泛脫髓鞘超出軟膜達到實質;4分,大范圍的白質內脫髓鞘但不超過橫斷面的一半面積;5分,一半或一半以上橫斷面的主要白質內脫髓鞘。

1.4 病理圖像分析 采用Axioplan Zeiss圖像分析系統(tǒng)對染色結果進行定量分析,每張切片隨機選取5個高倍視野(×400),定量分析并評分,求其平均值。對免疫組化染色進行定量分析,每張切片隨機選取5個高倍視野(×200),據(jù)陽性免疫反應的圖象灰度選擇合適的灰度分割閾值,測定陽性免疫染色強度及面積。免疫組化評分(IHS)方法參照文獻[8]結合陽性細胞百分比及染色強弱兩個方面聯(lián)合評分(均按上限):A為陽性細胞數(shù)分級(0～1%=0、2%～10%=1、11%～ 50%=2、51%～ 80%=3、81%～100%=4),B為陽性細胞顯色強度分級(0級:陰性;1級:弱陽性;2級:陽性;3級:強陽性),A、B兩項乘積即為該組織的IHS。

1.5 纖維蛋白的免疫熒光檢測及血清纖維蛋白原濃度測定 免疫后30、40、60天每組處死發(fā)病小鼠各2只,EAE對照組、預防組及治療組小鼠各取冰凍切片進行纖維蛋白免疫熒光染色,在熒光顯微鏡下觀察并量化分析。每組剩余小鼠于免疫后60天全部處死,冰上迅速取材并提取蛋白及RNA,同時將小鼠眼靜脈取血送我院檢驗科檢測血清纖維蛋白原濃度。

1.6 采用常規(guī)的Western blot方法測定脊髓髓鞘堿性蛋白(MBP)、主要組織相容性復合物(MHC-Ⅰ)及磷酸化蛋白激酶(p-Akt)的蛋白表達,熒光定量PCR方法(兩步法)測定MBP和組織型纖溶酶原激活物(t-PA)的表達。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,各項指標以±s,多組樣本均數(shù)比較進行單因素完全隨機方差分析(ANOVA),量化評分后三組評分的比較采用Mann-Whitney檢驗。P＜0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 降纖治療對EAE小鼠臨床過程的改善 采用MOG誘導的C57BL/6 EAE小鼠模型,在免疫后13天左右陸續(xù)出現(xiàn)癥狀,逐漸表現(xiàn)為尾部張力減低,雙后肢無力,行走拖拉緩慢。隔日給藥并觀察小鼠發(fā)病情況進行臨床評分。與EAE未用藥對照組相比,降纖預防組及治療組小鼠的臨床癥狀減輕,平均臨床評分有明顯減低(P＜0.05,圖1A)。EAE對照組、預防組及治療組的平均發(fā)病時間分別為免疫后7、10、29 天,達峰時間分別為免疫后 29、29、40 天 。在免疫后第27天[平均臨床評分:EAE對照組1.0±0.12(n=12),預防組 0.20±0.09(n=8),治療組0.05±0.02(n=8)]和免疫后第35天[平均臨床評分:EAE對照組1.40±0.10(n=9),預防組0.12±0.05(n=5),治療組 0.68±0.13(n=8)],巴曲酶降纖預防組及治療組小鼠臨床評分平均值較EAE對照組有明顯降低(P＜0.05,圖1B)。

圖1 巴曲酶降纖治療降低臨床評分并減輕臨床癥狀Fig.1 Batroxobin administration ameliorated clinical score and clinical symptoms

2.2 降纖治療減輕了炎癥和脫髓鞘,但軸索損傷無顯著差別 HE染色顯示,EAE對照組小鼠脊髓內出現(xiàn)輕至中度炎性細胞浸潤,而預防組和治療組炎性細胞浸潤明顯減輕(圖2)。經量化分析得到炎癥評分,巴曲酶降纖預防組(1.10±0.21)及治療組(1.40±0.13)組較EAE對照組(3.20±0.15)小鼠的脊髓炎性細胞浸潤程度明顯降低(P＜0.05)。預防組及治療組小鼠小腦白質內炎性細胞浸潤較EAE對照組亦有一定程度的減輕(圖3)。LFB染色顯示巴曲酶降纖預防及治療組小鼠脊髓白質內脫髓鞘程度較EAE未用藥對照組明顯減輕,EAE未用藥對照組小鼠脊髓白質內髓鞘脫失較嚴重,而預防組和治療組髓鞘脫失均較輕微(圖4),量化評分分析表明,預防組(1.10±0.12)及治療組(1.70±0.25)脫髓鞘程度評分較對照組(3.10±0.21)明顯降低(P＜0.05)。軸索染色可見銀染結構欠完整、著色不均勻,軸索廣泛缺失(圖5),以EAE未用藥對照組軸索損害最為嚴重(89%),巴曲酶預防組軸索損害為80%,而治療組脊髓軸索損害為75%,經量化分析后各組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖2 EAE對照組、巴曲酶預防組及治療組小鼠脊髓內炎性浸潤情況比較(HE染色)Fig.2 Comparison of inflammatory infiltration in spinal cord in EAE control,prevention and suppression groups using HE staining

圖3 各組小鼠小腦白質內炎性浸潤情況(HE染色)Fig.3 Comparison of inflammatory infiltration in whitematter of cerebellum in each group using HE staining

空白對照組,EAE未給藥組,預防組及治療組的小鼠脊髓及小腦組織行HE染色。在EAE未給藥小鼠脊髓、小腦白質內及軟膜下炎性細胞廣泛浸潤,而巴曲酶預防組及治療組中炎性細胞浸潤主要集中在軟膜附近。

2.3 EAE小鼠免疫組織化學特點及降纖治療效果

圖4 各組小鼠脊髓白質內髓鞘脫失情況(LFB染色)Fig.4 Luxol fast blue(LFB)stainingdemonstrated myelin loss in the white matter of spinal cords

圖5 各組小鼠脊髓軸索染色情況Fig.5 Comparison of silver impregnaion for axon

用MBP抗體的免疫組織化學染色標記各組小鼠小腦白質內的髓鞘蛋白。在EAE未用藥組小鼠小腦白質內可見廣泛的點狀脫髓鞘改變,MBP陽性表達較巴曲酶預防組和治療組少(圖6)。巴曲酶預防組及治療組的MBP的IHS較EAE對照組明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在髓鞘脫失的同時,星形膠質細胞大量激活。通過抗膠質纖維酸性蛋白(GFAP)抗體的免疫組化染色標記活化的星形膠質細胞發(fā)現(xiàn):與EAE未用藥對照組相比,巴曲酶預防組和治療組的GFAP陽性細胞數(shù)明顯減少,主要表現(xiàn)為小鼠小腦白質內彌漫性GFAP陽性表達減少(圖7)。經免疫組化評分顯示,巴曲酶降纖預防組及治療組GFAP的IHS較EAE對照組明顯減低(P＜0.05)。MBP和GFAP免疫熒光雙標分析顯示:與EAE對照組相比,巴曲酶預防組和治療組小鼠小腦白質內MBP(綠色)表達增高,而GFAP(紅色)表達降低(圖8)。

圖6 EAE對照組小鼠小腦白質內廣泛的點狀脫髓鞘改變(MBP免疫組織化學染色)Fig.6 Multifocal widespread areas of myelin damage were observed in cerebellar white matter of EAE mice by immunochemistry analysis

圖7 與EAE未用藥對照組相比,巴曲酶預防組和治療組的GFAP陽性細胞數(shù)明顯減少(免疫組織化學染色)Fig.7 Immunostaining sections showed dramatic reduction in GFAP-positive cells in prevention and suppression group mice as compared with controls

2.4 降纖治療減少了病灶周圍纖維蛋白的沉積

圖8 MBP和GFAP免疫熒光雙標分析(免疫熒光染色)Fig.8 MBP and GFAP assay using double-labelling immunofluorescence

經纖維蛋白免疫熒光檢測,在EAE對照組小鼠小腦白質內可見纖維蛋白陽性物質點片狀沉積,而巴曲酶預防組和治療組小鼠小腦切片中纖維蛋白陽性物質沉積明顯減少(圖9)。IHS分析顯示:預防組和治療組較EAE對照組纖維蛋白的沉積有明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。小鼠眼球靜脈血血清中纖維蛋白原濃度(g/L)在EAE組、預防組及治療組分別為3.15±0.33、2.78±0.13和2.98±0.82,預防組與治療組的血清纖維蛋白原濃度平均值有下降趨勢,但與EAE組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.5 降纖治療對小鼠脊髓MHCⅠ、p-Akt及MBP蛋白表達的影響 在EAE對照組、巴曲酶預防組及治療組小鼠脊髓中MHC-Ⅰ類的蛋白表達水平無明顯差異;而巴曲酶預防組及治療組較EAE對照組小鼠脊髓中的p-Akt蛋白表達降低,MBP蛋白表達升高(圖 10)。

2.6 實時熒光定量PCR檢測各組小鼠脊髓中t-PA及MBP的mRNA表達 t-PA特異性擴增對應的Tm為(76.74±0.65)℃,MBP的 Tm為(73.34±0.85)℃,β-actin的Tm 為(84.48±0.51)℃,熔解曲線分析確定PCR產物的特異性(圖11)。EAE對照組、巴曲酶預防組和治療組小鼠t-PA mRNA的表達(t-PA/β-actin)分別為 0.34±0.53、5.83±1.22和9.78±0.98,巴曲酶預防組與治療組t-PA mRNA的表達明顯高于EAE對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。各組小鼠MBPmRNA的表達(MBP/β-actin):分別為0.78±0.34(EAE對照組)、2.53±0.87(巴曲酶治療組)和4.96±1.23(巴曲酶預防組),巴曲酶預防組與治療組MBP mRNA的表達明顯高于EAE對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖10 Western blot方法檢測MHCⅠ,p-Akt及MBP蛋白表達Fig.10 MHCⅠ,p-Akt and MBPexpression were assessed by Western blot

3 討論

MOG誘導的EAE小鼠模型的建立,為我們探討MS的發(fā)病機制提供了有效的研究手段。我們已利用MOG35-55片段免疫C57小鼠成功建立了慢性單時相EAE模型[9]。MS的病理改變除了脫髓鞘、軸索損傷及膠質細胞增生外,還包括血管周圍大量的纖維蛋白沉積,學者們已在豚鼠、大鼠、小鼠等多種動物誘發(fā)的 EAE中發(fā)現(xiàn)有纖維蛋白沉積廣泛存在[10]。在我們的研究中,使EAE小鼠模型降低纖維蛋白能夠明顯減輕小鼠的臨床癥狀及炎性脫髓鞘改變,不僅能明顯改善臨床表現(xiàn),降低臨床評分,而且能夠減輕膠質細胞的活性。

有學者研究發(fā)現(xiàn),在臨床癥狀出現(xiàn)之前EAE小鼠體內的凝血系統(tǒng)活性增高、纖溶活性降低,提示凝血-纖溶系統(tǒng)在 EAE發(fā)病中起非常重要的作用[11,12]。已有研究證實,纖維蛋白不僅在凝血纖溶系統(tǒng)中起重要作用,而且在炎癥反應和損傷修復中也起重要作用[13]。纖維蛋白的結構復雜性決定了其功能多樣性,它在MS發(fā)病過程中的作用可能是多方面的,不僅參與了血腦屏障通透性的增加及炎性細胞浸潤引起的髓鞘脫失,而且通過細胞因子的調控發(fā)揮多種生物學功能。此外,MS早期炎性脫髓鞘病理過程中纖維蛋白除了通過被破壞的血腦屏障進入中樞神經系統(tǒng)大量沉積,使得激活的巨噬細胞和淋巴細胞從外周循環(huán)系統(tǒng)進入中樞神經系統(tǒng),同時激活星形膠質細胞和小膠質細胞,引起脫髓鞘和軸索損傷[14]。炎癥和凝血過程是相互聯(lián)系的,很多炎癥反應以凝血激活和纖維蛋白沉積為特征。在炎癥發(fā)生的同時凝血酶能引起血管通透性的增加,誘導內皮細胞黏附于中性粒細胞,刺激單核細胞和中性粒細胞的趨化性,引起血腦屏障通透性增高、凝血酶活性增加、不溶性的纖維蛋白形成并沉積在中樞神經系統(tǒng)血管周圍[15,16]。

不論是通過遺傳學還是藥理學手段降低纖維蛋白,均可不同程度減輕EAE動物的發(fā)病。纖維蛋白源性的γ377-395多肽注入EAE小鼠體內后可明顯減低臨床評分和炎癥反應。藥物降纖也可以減輕臨床癥狀,改善炎癥反應,降低小膠質細胞的活性[4]。最早應用的降纖藥物安克洛酶可以減輕腫瘤壞死因子(TNF)轉基因小鼠的炎性脫髓鞘反應,延遲疾病的發(fā)生[5]。巴曲酶具有降低纖維蛋白原和抗凝作用,誘發(fā)t-PA的釋放并增強t-PA的作用,并促進纖維蛋白溶酶的生成等。進一步的研究發(fā)現(xiàn),在細胞轉染以及分離病毒誘導的EAE模型中,巴曲酶可以明顯減輕臨床癥狀,降低臨床評分[6]。在我們的研究中首次采用MOG誘導的EAE小鼠模型,連續(xù)給予巴曲酶后可使小鼠的臨床癥狀減輕,臨床評分降低,不論是預防組還是治療組與對照組相比,均有明顯的改善效果。值得注意的是,我們給予巴曲酶預防及治療降纖的同時,小鼠眼球靜脈血中檢測的纖維蛋白原濃度平均值有所降低,但各組間差別無明顯統(tǒng)計學意義,小鼠均未出現(xiàn)出血等副作用。

在EAE小鼠模型中,巴曲酶能有效改善發(fā)病動物的臨床癥狀和發(fā)病過程,主要是由于抑制了纖維蛋白原的致炎特性而不是其促凝血特性[4]。在EAE早期,隨著血腦屏障的破壞,中樞神經系統(tǒng)血管周圍纖維蛋白原沉積,作為具有多種生物活性的物質,纖維蛋白原可能通過多種途徑參與EAE的發(fā)病過程,但具體機制仍不是很清楚。目前得到廣泛認可的是纖維蛋白原可作為小膠質細胞的調控子參與EAE的發(fā)病過程?；|中纖維蛋白的沉積可刺激小膠質細胞活化,活化的小膠質細胞通過釋放細胞因子和一氧化氮(NO),促進神經元和少突膠質細胞的凋亡[4]。在中樞神經系統(tǒng)中,除小膠質細胞外,還有星形膠質細胞和少突膠質細胞,少突膠質細胞形成中樞神經纖維髓鞘,而星形膠質細胞參與膠質瘢痕的形成,二者功能的變化與MS的發(fā)生有密切關系。纖維蛋白可以通過調控巨噬細胞、小膠質細胞及星形膠質細胞來參與炎癥反應。我們的研究證實,巴曲酶對纖維蛋白原誘導的巨噬細胞炎癥反應的改善情況,巴曲酶預防和治療組較對照組GFAP陽性表達的星形膠質細胞激活明顯減少,表明巴曲酶可以抑制星形膠質細胞活性。此外,我們得到的結果還表明,巴曲酶可導致其下游激活的磷酸化Akt信號通路下調,從而最終減輕炎癥反應,與文獻報道一致[4,5]。

我們研究發(fā)現(xiàn),清除了纖維蛋白原的小鼠MBP陽性細胞數(shù)明顯增加,而且在RNA水平也發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原可抑制MBP的表達,提示在中樞神經系統(tǒng)中調控纖維蛋白原的沉積可能是神經損傷后修復的一個關鍵因素。有學者通過對MS患者的腦脊液研究發(fā)現(xiàn),GFAP水平與患者臨床殘疾評分(EDSS)有關,GFAP越高EDSS評分也越高,故它可以作為不可逆損害的標志,但GFAP的升高沒有特異性,反應性的膠質增生可見于多種疾病[17]。本組實驗中EAE未用藥組小鼠脊髓中有大量纖維蛋白沉積,刺激了星形膠質細胞的增生,引起臨床癥狀的惡化,造成神經功能的不可逆損害,而使用巴曲酶后,星形膠質細胞增生減少,減緩了神經膠質瘢痕的形成,臨床癥狀輕且預后好,不可逆的神經功能障礙幾率降低,故我們推測臨床使用可能會改善患者的預后。

纖維蛋白沉積的同時,纖溶系統(tǒng)亦出現(xiàn)上調[18]。組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)調節(jié)的纖溶作用能夠產生一種“保護機制”,即隨著纖維蛋白沉積,纖溶系統(tǒng)上調增強纖維蛋白的溶解對機體來說是一種保護作用,早期的纖維蛋白增加是機體對抗炎癥與損傷的保護反應;當病程進展纖維蛋白大量沉積,又會加重MS病情。因此,在MS發(fā)病過程中,纖維蛋白既發(fā)揮了神經保護作用又啟動了炎性脫髓鞘的病理過程,引起相應的神經損傷。

我們目前的實驗中,巴曲酶預防組和治療組與EAE對照組相比,小鼠脊髓和小腦的炎性脫髓鞘反應明顯減輕,然而,纖維蛋白介導的炎性脫髓鞘作用機制還不是十分清楚,但至少可以通過降纖改善EAE小鼠的炎癥反應,提示我們將纖維蛋白作為一種治療靶標有利于今后應用于MS患者的疾病預防和治療。

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