方士英 徐茂紅 葉良兵 顧宏霞 鮑玲玲 張小勇 (皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系,六安237000)

冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps sinensis(Berk)sacc)屬肉座菌目麥角菌科蟲(chóng)草屬植物,為蟲(chóng)草菌的子座與其寄主蝙蝠蛾(Hepialus armoricanuss oberthiir)幼蟲(chóng)尸體的復(fù)合物,俗稱(chēng)蟲(chóng)草,是我國(guó)傳統(tǒng)的滋補(bǔ)性中藥材。冬蟲(chóng)夏草性溫、味甘,具有補(bǔ)腎益肺,止血化痰的作用。用于腎虛精虧、陽(yáng)痿遺精、腰膝酸痛、久咳虛喘、勞嗽咯血等[1]。天然蟲(chóng)草由于受到嚴(yán)格的寄生性及特殊的生長(zhǎng)地理?xiàng)l件的限制,產(chǎn)量有限,藥源相當(dāng)緊缺。近年來(lái),許多研究人員致力于人工蟲(chóng)草新資源、新品種的研究與開(kāi)發(fā)。古尼蟲(chóng)草小孢變種(Cordyceps gunni var minor nov)是在安徽境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的古尼蟲(chóng)草的新變種,其蟲(chóng)草多糖對(duì)化學(xué)性肝損傷具有保護(hù)作用[2]。為進(jìn)一步研究其保肝作用,我們對(duì)古尼蟲(chóng)草小孢變種多糖保護(hù)免疫性肝損傷作用及其部分作用機(jī)制進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 藥物 蟲(chóng)草多糖(多糖含量＞50%):由安徽林苑蟲(chóng)草研究所提供。BCG:上海生物制品研究所(20030101)。LPS:美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。云芝多糖膠囊:南京老山制藥有限公司(020401)。SOD測(cè)試盒、MDA 測(cè)試盒、AST測(cè)試盒、ALT測(cè)試盒:南京建成生物工程 研究 所(20030702、20030618、20030707、20030702)。IL-1測(cè)試盒、TNF-α測(cè)試盒:美國(guó) TPI公司產(chǎn)品(2003071512、2003071512)。蟲(chóng)草多糖、云芝多糖(PCV)用前均用10%羧甲基纖維素鈉(CMCNa)溶液配成相應(yīng)濃度。

1.1.1 動(dòng)物 昆明小鼠,雄性,(20±2)克,由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第01號(hào)。

1.1.2 儀器 Multiskan MK3酶標(biāo)儀,上海雷勃分析儀器有限公司722S分光光度儀,上海精密科學(xué)儀器公司產(chǎn)品。BP211D電子天平,德國(guó)Sartarius生產(chǎn)。DL-5M高速冷凍離心機(jī),湖南離心機(jī)廠(chǎng)產(chǎn)品。GSY-8電熱恒溫水浴鍋,北京醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)意成公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠免疫性肝損傷模型的制備及給藥方法

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2天,隨機(jī)分成6組,每組10只,即:正常對(duì)照組、BCG+LPS模型組、云芝多糖(1 000 mg/kg)陽(yáng)性對(duì)照組。蟲(chóng)草多糖小劑量組:125 mg/kg,中劑量組:250 mg/kg,大劑量組:500 mg/kg。

參照文獻(xiàn)[3]制作小鼠免疫性肝損傷模型,即由尾靜脈iv 0.2 ml內(nèi)含BCG 2.5 mg的生理鹽水懸液,12天后每鼠尾靜脈iv LPS 10μg,16小時(shí)后處死小鼠,取血和肝組織作有關(guān)檢測(cè)。在造模過(guò)程中,實(shí)驗(yàn)組每日灌胃相應(yīng)劑量的蟲(chóng)草多糖(125、250、500 mg/kg),陽(yáng)性對(duì)照組每日灌胃云芝多糖(1 000 mg/kg),正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等量10%羧甲基纖維素鈉溶液,連續(xù)12天。

1.2.2 肝損傷指標(biāo)的檢測(cè) 尾靜脈iv LPS 16小時(shí)后摘除小鼠眼球取血,分離血清,比色法測(cè)定ALT、AST;同時(shí),脫臼頸椎處死小鼠,取肝臟左葉相同部位,用10%福爾馬林液固定,作病理檢查,按肝臟壞死程度進(jìn)行編秩,累計(jì)每組動(dòng)物肝壞死級(jí)數(shù),用秩和檢驗(yàn)方法計(jì)算每組動(dòng)物肝臟壞死程度的平均秩次。選肝臟右葉用冷生理鹽水漂洗去除積血,拭凈后再用冷生理鹽水制備10%肝勻漿,分別按TBA法和NBT法測(cè)MDA和SOD的含量。用ELISA法測(cè)定肝勻漿中TNF-α和IL-1的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS軟件包進(jìn)行處理。各項(xiàng)數(shù)據(jù)以±s表示,用 t檢驗(yàn)比較組間差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 蟲(chóng)草多糖對(duì)血清轉(zhuǎn)氨酶和SOD、MDA的影響

蟲(chóng)草多糖(125、250、500 mg/kg)均可使 BCG+LPS誘導(dǎo)的小鼠血清ALT、AST升高的活性降低,并能降低肝勻漿中MDA的水平,提高SOD的活性,見(jiàn)表1。

表1 蟲(chóng)草多糖對(duì)BCG+LPS誘導(dǎo)的小鼠血清中ALT、AST、肝勻漿中 SOD活性和MDA含量的影響(±s,n=10)Tab.1 Influence of CP on ALT、AST activities in serum and SOD activity、MDA contents in liver homogenates in mice induced by BCG+LPS( ±s,n=10)

表1 蟲(chóng)草多糖對(duì)BCG+LPS誘導(dǎo)的小鼠血清中ALT、AST、肝勻漿中 SOD活性和MDA含量的影響(±s,n=10)Tab.1 Influence of CP on ALT、AST activities in serum and SOD activity、MDA contents in liver homogenates in mice induced by BCG+LPS( ±s,n=10)

Note:Compared with normal group,1)P＜0.01;compared with model group,2)P＜0.01.

Groups ALT(U/L) AST(U/L) SOD(U/mg prot) MDA(nmol/mg prot)Normal 380.0±46.8 366.7±89.5 13.8±1.9 1.8±0.6 Model 1 658.7±213.71) 1 111.6±208.11) 2.2±0.71) 17.3±2.41)Low dose 1 351.7±185.32) 866.6±111.72) 4.1±1.12) 14.4±2.92)Medium dose 1 009.3±151.42) 649.2±127.72) 7.9±1.02) 11.8±2.42)High dose 642.7±138.62) 397.6±108.82) 12.2±3.02) 8.0±1.22)PCV 516.0±194.42) 336.2±41.62) 10.0±1.82) 6.5±1.62)

表2 蟲(chóng)草多糖對(duì)BCG+LPS誘導(dǎo)的小鼠肝勻漿中TNF-α和 IL-1含量的影響(±s,n=10)Tab.2 Influence of CP on TNF-αand IL-1 production in liver homogenates in miceinduced by BCG+LPS±s,n=10)

表2 蟲(chóng)草多糖對(duì)BCG+LPS誘導(dǎo)的小鼠肝勻漿中TNF-α和 IL-1含量的影響(±s,n=10)Tab.2 Influence of CP on TNF-αand IL-1 production in liver homogenates in miceinduced by BCG+LPS±s,n=10)

Note:Compared with normal group,1)P＜0.01;compared with model group,2)P＜0.01.

Groups Dose(mg/kg)TNF-α(ng/mg prot)IL-1(ng/mg prot)Normal 0.9±0.4 3.3±1.4 Model 49.7±10.51) 124.9±22.41)Low dose 125 35.4±6.82) 103.0±13.82)Medium dose 250 17.2±4.92) 51.7±9.92)High dose 500 11.3±3.62) 33.2±8.32)PCV 1 000 8.3±3.12) 22.6±8.82)

表3 蟲(chóng)草多糖對(duì)BCG+LPS誘導(dǎo)的小鼠肝損害的影響(±s,n=10)Tab.3 Influence of CP on hepatic injury in mice caused byBCG+LPS(±s,n=10)

表3 蟲(chóng)草多糖對(duì)BCG+LPS誘導(dǎo)的小鼠肝損害的影響(±s,n=10)Tab.3 Influence of CP on hepatic injury in mice caused byBCG+LPS(±s,n=10)

Note:Compared with normal group,1)P＜0.01;compared withmodel group,2)P＜0.01.

Groups Degree of hepatic cell narocis Normal 0 Model 44.71)Low dose 33.42)Medium dose 28.32)High dose 11.22)PCV 9.12)

圖1 CP對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)的影響(×100)Fig.1 Influence of CP on pathology of hepatic injury in mice caused by BCG+LPS(×100)

2.2 蟲(chóng)草多糖對(duì)肝勻漿中TNF-α和IL-1含量的影響 蟲(chóng)草多糖(125、250、500 mg/kg)均可使 BCG+LPS誘導(dǎo)的小鼠肝勻漿中升高的TNF-α和IL-1的含量顯著降低,見(jiàn)表2。

2.3 病理檢查結(jié)果 實(shí)驗(yàn)正常對(duì)照組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)完整;BCG+LPS模型組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂,腫脹及氣球樣變,肝中央靜脈周?chē)写蠓秶母渭?xì)胞變性壞死。隨蟲(chóng)草多糖劑量的增大,對(duì)肝臟的保護(hù)作用也隨之增強(qiáng)。其中高劑量的蟲(chóng)草多糖對(duì)肝臟具有較好的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)中,陽(yáng)性對(duì)照藥云芝多糖也呈現(xiàn)出較好的保肝作用。結(jié)果見(jiàn)表3,代表性病理圖見(jiàn)圖1。

3 討論

給小鼠注射BCG可使巨噬細(xì)胞和中性多核細(xì)胞聚集于肝臟,使肝臟處于致敏狀態(tài)。繼而用低毒劑量的LPS攻擊,可激發(fā)這些細(xì)胞釋放TNF-α等炎癥因子,造成肝臟炎癥、壞死。本實(shí)驗(yàn)在采用序貫注射BCG+LPS后,成功誘導(dǎo)了免疫性肝損傷模型,小鼠血漿中轉(zhuǎn)氨酶水平和肝勻漿中MDA含量顯著升高,肝臟出現(xiàn)不同程度炎細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死。實(shí)驗(yàn)中蟲(chóng)草多糖可顯著降低BCG+LPS誘導(dǎo)肝損傷后小鼠血清中AST、ALT活性和肝中MDA的含量,并能提高肝中SOD的活性,表明蟲(chóng)草多糖具有抑制肝細(xì)胞損傷的作用。

MDA的測(cè)定廣泛用于發(fā)現(xiàn)氧自由基介導(dǎo)的細(xì)胞損傷,其含量的高低可間接反映機(jī)體細(xì)胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度;而自體的SOD能清除超氧陰離子自由基,保護(hù)細(xì)胞免受損傷,其活力的高低能反映機(jī)體清除氧自由基的能力[4]。本研究模型組小鼠肝組織中MDA顯著高于正常組,表明序貫注射BCG+LPS致小鼠肝組織損傷,肝臟氧化代謝改變,線(xiàn)粒體等細(xì)胞器功能障礙,能量代謝障礙,引起細(xì)胞質(zhì)膜破壞,肝細(xì)胞變性、壞死[5]。實(shí)驗(yàn)組冬蟲(chóng)夏草多糖三個(gè)劑量組(125、250、500 mg/kg)ig給藥明顯降低了BCG+LPS誘導(dǎo)的免疫性肝損傷后小鼠血清中升高的ALT和AST水平,抑制肝勻漿中上升的MDA水平和升高降低的SOD活性。表1中實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明蟲(chóng)草多糖可直接清除體內(nèi)過(guò)剩自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物(MDA),或通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶(SOD)活力起增強(qiáng)抗氧化作用,有效地防止或減輕體內(nèi)自由基所導(dǎo)致的氧化損傷,增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。

為進(jìn)一步探討蟲(chóng)草多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷的作用機(jī)制,我們采用ELISA法對(duì)肝組織中TNF-α、IL-1含量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織中兩者的含量明顯低于模型組。

TNF-α是肝臟損傷的重要介質(zhì),是一種多效的促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子,主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,其對(duì)肝產(chǎn)生毒性的機(jī)制主要是:刺激細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的刺激因子,在轉(zhuǎn)錄終止水平以下可在體內(nèi)外誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞凋亡;可誘發(fā)中性粒細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞粘附或活化中性粒細(xì)胞,促使其趨化聚集于肝臟,釋放蛋白酶或氧自由基,造成肝細(xì)胞損傷[6]。更為重要的是TNF-α可作為肝損傷的第一介質(zhì),其出現(xiàn)時(shí)將引起許多與肝壞死有關(guān)的第二介質(zhì),如 NO、IL-1、IL-6、IL-8、sIL-2R等的產(chǎn)生,且IL-1等第二介質(zhì)又增強(qiáng)TNF-α的肝損傷作用,即使少量TNF存在,宿主也會(huì)發(fā)生組織損傷[6]。

TNF-α單獨(dú)并不引起明顯的肝臟損害,IL-1本身對(duì)肝臟也無(wú)損傷作用。但I(xiàn)L-1水平的上升可刺激各種免疫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子,介導(dǎo)肝臟的炎癥免疫損傷。特別是在IL-1存在時(shí),TNF-α致肝損傷作用顯著增強(qiáng)。此外,IL-1和 TNF-α、IFN-γ等又可協(xié)同作用于肝細(xì)胞,使iNOSmRNA表達(dá)增加,NO產(chǎn)生增多,肝損傷加重。

實(shí)驗(yàn)組小鼠肝勻漿中TNF-α生成明顯減少,表明蟲(chóng)草多糖可抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),穩(wěn)定生物膜,使細(xì)胞膜通透性降低,活躍肝細(xì)胞生物氧化功能和蛋白質(zhì)合成,減輕肝細(xì)胞變性和壞死,從而恢復(fù)肝細(xì)胞功能,起到保護(hù)肝臟的作用。

免疫性肝損傷的病理機(jī)制十分復(fù)雜,涉及到機(jī)體的免疫功能的紊亂、細(xì)胞因子之間的失衡和淋巴細(xì)胞活性的改變等。蟲(chóng)草多糖對(duì)免疫性肝損傷的保護(hù)作用是否與其調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、降低TNF-α、IL-1的含量、平衡細(xì)胞因子等有關(guān)值得進(jìn)一步研究。

1 國(guó)家藥典委員會(huì)編,中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技社,2010:106.

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3 魏 偉,吳希美,李元建.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第 4版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:1130-1131.

4 陳方軍,李 俊,王佳佳.玉屏風(fēng)多糖對(duì)小鼠化學(xué)性肝損傷的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011;46(1):49-52.

5 杜艷秋,趙 敏.葛根素對(duì)大鼠急性乙醇中毒性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2011;24(1):9-11.

6 李晶媛,李樹(shù)臣,楊維良.TNF-α誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡機(jī)制的回顧與展望[J].世界華人消化雜志,2007;15(6):606-611.