王 哲，王守巖，王德山，馬賢德，高 原，趙金茹，關(guān)洪全

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧沈陽110847)

腦血管疾病是危害人類生命和健康的主要疾病之一，缺血性腦血管病約占全部腦血管病患者的70% ～80%。腦缺血可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，它們可以與神經(jīng)干細胞上的相應(yīng)受體結(jié)合激活細胞內(nèi)的信號系統(tǒng)，從而促進其分化，部分地替代和修復(fù)受損的神經(jīng)元，從而在一定程度上改善神經(jīng)功能缺損。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain－derived neuro－trophic factor，BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族重要成員之一，近來研究已表明BDNF在腦缺血/再灌注缺血周邊區(qū)神經(jīng)元的損傷修復(fù)中發(fā)揮了重要作用［1］。眼針療法是我院著名老中醫(yī)彭靜山教授于70年代首創(chuàng)，在眼眶周圍用針刺等刺激防治疾病的一種微針療法。應(yīng)用于臨床30余年來，療效顯著。本研究通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察眼針對海馬組織BDNF表達變化的影響，旨在探討眼針治療腦缺血再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康 SPF級 SD大鼠 32只，雌雄不拘，體重(280±20)g，由北京維通利華實驗動物中心提供，許可證編號:SCXK(京)2007－0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水、攝取標準顆粒飼料，室內(nèi)溫度22℃，相對濕度45%。按隨機數(shù)字法將大鼠分為正常組、假手術(shù)組、模型組、眼針組4組，每組8只。

1.2 模型制備與評價

參照文獻［2］，模型組及眼針組采用改良的線栓法復(fù)制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。模型成功標準:大鼠于缺血2 h后進行再灌注，再灌注后進行神經(jīng)功能缺損評分，參照Longa 5分制評分標準［3］:0分為無癥狀;1分為不能完全伸展對側(cè)前爪;2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分為向?qū)?cè)傾倒;4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。評分為1～3分者納入實驗，未達標準者排除。假手術(shù)組術(shù)式同模型、眼針組，區(qū)別在于釣魚線插入深度為0.5～1 cm。正常組未做處理。

1.3 眼針取穴及刺法

眼針組:用31號13 mm毫針，定位參照人體取穴方法［4］，取肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)針刺。于大鼠眶緣處，采用眶上橫刺法，按照穴區(qū)定位線1→8的順序，從該穴區(qū)定位線一端進針，橫刺進針3 mm，到另一定位線，留針20 min，10 min時刮針1次，刮針5下。治療時機:3 h眼針組于腦缺血再灌注即刻及取材前30 min分別進行眼針治療2次。

圖1 大鼠穴區(qū)定位圖

1.4 試劑

實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa大連寶生物。BDNF引物由北京華大基因公司合成。親和純化兔抗鼠BDNF多克隆抗體、DAB染色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.5 指標測定

海馬組織BDNF蛋白表達(Western blot法):于缺血再灌注損傷3 h對大鼠給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頭取出腦組織，去掉小腦，沿兩側(cè)大腦半球連接處將大腦半球切開，剝離出病變側(cè)海馬，按海馬組織凈重:裂解液=1∶10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液，PH值為7.5，將樣品剪碎后勻漿、離心、上清即為總蛋白。兔抗鼠 BDNF一抗(1∶500);O－dianidine，βnaphthyl acid phosphate顯色;掃描儀掃描NC膜，分析結(jié)果。

海馬組織BDNF mRNA的表達:采用RQ－PCR方法:BDNF上游引物:5'ATGGGTTACACGAAGGA 3';BDNF下游引物:5'GCCCGAACATACGATT3'。β－actin為內(nèi)參，其上下游引物分別為:5'CGT GCGTGACATTAAAGAG 3'，5'TTGCCGATAGTGA TGACCT 3'。所有的產(chǎn)物，在ABI Prism 7500 HT序列檢測系統(tǒng)中運行。讀取CT值，以管家基因β－actin為內(nèi)參，以擴增倍數(shù)作為比較的依據(jù)，△CT=CT目的基因－CTβactin，△△CT=△CT實驗－△CT對照，擴增倍數(shù)=2－△△CT。將所擴增的PCR產(chǎn)物同時進行溶解曲線分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 眼針對急性腦缺血再灌注損傷3 h后大鼠神經(jīng)缺損評分影響

模型組和眼針組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，如提尾時左側(cè)前肢不能伸直，行走向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)或傾倒等;假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)。模型組造模后即刻與眼針組造模后即刻及模型組再灌注損傷3 h后神經(jīng)功能缺損評分無差異，眼針組再灌注損傷3 h后與造模后即刻神經(jīng)功能缺損評分有差異(P＜0.01)。見表1。

表1 眼針對腦缺血再灌注損傷3 h后神經(jīng)缺損評分影響

2.2 眼針對腦缺血再灌注損傷3 h后大鼠海馬組織BDNF蛋白表達的影響

圖2、表2為采用Western blot方法檢測結(jié)果:取大鼠右側(cè)海馬組織檢測BDNF蛋白，以β－actin為內(nèi)參，模型組海馬組織BDNF蛋白表達明顯低于正常組和假手術(shù)組，眼針組BDNF蛋白表達明顯高于模型組(P ＜0.01)。

表2 眼針對腦缺血再灌注損傷3 h后大鼠海馬組織BDNF蛋白表達影響

圖2 眼針對腦缺血再灌注損傷3 h后大鼠組織BDNF蛋白表達影響

2.3 眼針對腦缺血再灌注損傷3 h后大鼠海馬組織BDNF mRNA表達的影響

采用實時定量PCR方法檢測海馬組織BDNF mRNA表達如圖3、4、5所示，本實驗選用β－actin作為內(nèi)參，BDNF基因擴增產(chǎn)物大小為86 bp，β－actin基因擴增產(chǎn)物為132 bp。模型組海馬組織BDNF mRNA表達較正常組、假手術(shù)組減少，眼針組表達較模型組增高，均有顯著差異(P＜0.01)。

3 討論

隨著人口老齡化程度的加劇，腦血管疾病已成為倍受社會關(guān)注的問題。腦缺血是腦血管疾病主要病種，在我國，其死亡率僅次于惡性腫瘤，是對人類健康威脅十分嚴重的一類疾病，所以在臨床上如何減輕腦組織的損傷、保護神經(jīng)細胞免受損傷成為研究的熱點問題。中醫(yī)認為中風(fēng)病的發(fā)生與肝、脾、腎三臟功能失調(diào)有關(guān)，其表現(xiàn)為口眼喎斜、舌強語蹇、半身不遂。中風(fēng)治療的各個時期均可采用針灸療法，并取得肯定療效［5］。人體經(jīng)絡(luò)直接或間接與眼相連。正如《靈樞·邪氣臟腑 》曰:“十二經(jīng)脈，三百六十五絡(luò)，其血氣皆上于面而走空竅，其經(jīng)陽氣上走于目而為睛。”《靈樞·經(jīng)脈》曰:“諸脈皆屬于目?！毖叟c臟腑關(guān)系密切，眼的正常功能依賴五臟六腑之滋養(yǎng)。據(jù)此，我校著名老中醫(yī)彭靜山先生結(jié)合眼與經(jīng)絡(luò)、臟腑的關(guān)系，經(jīng)過長期臨床實踐，創(chuàng)立了眼針療法，在白睛脈絡(luò)異常部位的眼眶內(nèi)針刺治療，常常收到奇效。另有研究結(jié)果表明眼針療法對腦供血不足患者治療效果確切顯著，是一種簡便有效、無不良反應(yīng)、易于推廣的療法［6］。但是眼針治療中風(fēng)病等的機制是否與BDNF表達變化有關(guān)尚未見報道。

圖5 眼針對腦缺血再灌注損傷3 h后大鼠海馬組織BDNFmRNA表達影響

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一。腦缺血后BDNF蛋白和其mRNA的表達均會發(fā)生相應(yīng)改變。Lee等發(fā)現(xiàn)缺血1周后可見年輕大鼠海馬CA區(qū)和皮層內(nèi) BDNF蛋白的表達明顯增加［7］。BDNF是由Barde等［8］在1982年從豬腦中首先分離和純化，屬于神經(jīng)生長因子家族成員，在維持神經(jīng)元功能及其損傷后再生修復(fù)方面發(fā)揮著重要作用，體外及體內(nèi)實驗研究均證實BDNF在神經(jīng)元存活、神經(jīng)發(fā)生分化和增殖以及學(xué)習(xí)、記憶等方面扮演著重要的角色［9］。BDNF由神經(jīng)細胞合成并廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，以大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體分布最為豐富。

本實驗通過眼針刺激缺血再灌注損傷模型大鼠，根據(jù)肝腎陰虛為中風(fēng)病的基本病機之一，偏癱的上、下肢分別歸屬上焦區(qū)、下焦區(qū)，眼針取肝區(qū)、腎區(qū)以滋補肝腎治病求本，取上焦區(qū)、下焦區(qū)以活血通絡(luò)治其標，結(jié)果顯示缺血再灌注損傷3 h眼針組BDNF的蛋白表達及基因表達均較模型組升高，同時眼針組大鼠神經(jīng)功能缺損較模型組減輕，說明眼針刺激能上調(diào)病變側(cè)海馬組織BDNF的表達，減輕腦缺血再灌注損傷。表明眼針刺激肝區(qū)、腎區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)，可能是通過調(diào)節(jié)BDNF的表達，促進神經(jīng)元的損傷修復(fù)來減輕腦缺血再灌注損傷。

［1］劉崴，程焱，王虔.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子與缺血性腦損傷［J］.國外醫(yī)學(xué)·腦血管疾病分冊，2004，12(6):433－436

［2］馬賢德，孫宏偉，柴紀嚴，等.線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27(6):1200 －1201

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84－91

［4］彭靜山.眼針療法［M］.沈陽:遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1990:11

［5］田維柱.中華眼針［M］.沈陽:遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1998:78－88

［6］李志.眼針改善慢性腦供血不足患者認知功能障礙［J］.中國針灸，2009，29(10):791 －793

［7］Lee TH，Yang JT，Kato H，et al.Expression of brain － derived neurotrophic factor immunoreactivity and mRNA in the hippocampal CA1 and cortical areas after chronic ischeia in rats［J］.J Neurosci Res，2004，76(5):705 －712

［8］Barde Y A，EdgarD，Thoenen H.Purification of a new neurotrophic factor from mammalian brain［J］.J EMBO，1982，1:549 －553

［9］Marini A M，J iang X，Wu X，et al.Preconditioning and neurotophins:amodel for brain adaptation to seizures，ischemia and other stressful stimuli［J］.Am ino Acids，2007，32:2992304