王宗春，姜俊勇，周延安，宋金春

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430060)

注射用還原型谷胱甘肽鈉臨床用于化學(xué)治療(尤其是大劑量化學(xué)治療)、放射治療、肝臟疾病、低氧血癥以及有機(jī)磷、胺基或硝基化合物中毒的輔助治療。2010年版《中國藥典(二部)》中關(guān)于注射劑熱原檢查方法有家兔法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法2種，其中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、簡便易行等優(yōu)點(diǎn)，已被各國藥典所采用。目前尚未有注射用還原型谷胱甘肽鈉細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的報道，筆者參照2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅪE方法[1]，對本品進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究。

1 儀器與試藥

恒溫水浴箱(江蘇南通嘉程儀器有限公司);微量取液器(50～250 μL，上海金林生化試劑儀器廠);SW－80A型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用具(廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠)。注射用還原型谷胱甘肽鈉(昆明積大制藥有限公司，規(guī)格為0.6 g/瓶，批號為091205，100212，100409);細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET用水，廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠，規(guī)格為10 mL/支，批號為091201);細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，規(guī)格為10 EU/支，批號為2009－7);鱟試劑(TAL，廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠，規(guī)格為 0.1 mL，批號為091149，標(biāo)示靈敏度為0.5 EU/mL;湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格為 0.1 mL，批號為 090325，標(biāo)示靈敏度為 0.5 EU/mL)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

按2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅪE方法[1]操作。結(jié)果表明，兩批鱟試劑靈敏度測定值 λc均在0.5～2.0 λ之間，符合規(guī)定。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)的確定

細(xì)菌內(nèi)毒素限值 L=K/M[1]。式中 K為人每千克體重每小時最大可接受的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量，注射劑為5 EU/(kg·h);M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，人均體重以60 kg計(jì)算，按照注射用還原型谷胱甘肽鈉說明書用法用量，本品成人1次最大劑量為 2.4 g，1 h 內(nèi)滴注完畢，M=2400/(60 ×1)=40 mg/(kg·h)，因此本品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值 L=K/M=0.125 EU/mg。

2.3 樣品最小有效稀釋濃度(C)的確定

樣品有效稀釋濃度 C=λ/L。其中 λ為鱟試劑靈敏度，L為細(xì)菌內(nèi)毒素限值，即0.125 EU/mg，目前市售的鱟試劑 λ常為 0.5，0.25，0.125，0.06，0.03 EU/mL，對應(yīng)的樣品最小有效稀釋濃度為4.0，2.0，1.0，0.5，0.25 g/L。

2.4 干擾預(yù)試驗(yàn)[2－3]

用BET用水將注射用還原型谷胱甘肽鈉配制成質(zhì)量濃度分別為 4.0，2.0，1.0，0.5，0.25 g/L 的系列溶液，作為供試品陰性對照(NPC)系列。另制備同樣質(zhì)量濃度的供試品系列溶液，使每一質(zhì)量濃度的供試品溶液中均含有2 λ細(xì)菌內(nèi)毒素，作為供試品陽性對照(PPC)系列。每一供試品濃度重復(fù)兩管，按常規(guī)設(shè)立陽性對照(PC)管和陰性對照(NC)管。用 λ為0.5 EU/mL的鱟試劑與上述系列溶液進(jìn)行反應(yīng)，依法[1]操作，結(jié)果顯示以上質(zhì)量濃度的供試品對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均無干擾現(xiàn)象。為了找出最大不干擾濃度，將樣品配制成質(zhì)量濃度分別為 64.0，32.0，16.0，12.0，8.0 g/L 的系列溶液，同法試驗(yàn)，結(jié)果見表1。初步判斷最大不干擾質(zhì)量濃度為8.0 g/L。

表1 干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.5 干擾試驗(yàn)

根據(jù)干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用質(zhì)量濃度為8.0 g/L的供試品溶液及BET用水分別稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，配成細(xì)菌內(nèi)毒素最終濃度分別為 1.0，0.5，0.25，0.125 EU/mL 的系列溶液，分別取 0.1 mL加入到已復(fù)溶的兩個不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑(λ為0.5 EU/mL)管內(nèi)，每個濃度平行做4管，另取供試品溶液做2支陰性對照管，依法[1]進(jìn)行干擾試驗(yàn)。結(jié)果見表 2。Et/Es在 0.5～2 之間(Es為以BET用水制成的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，Et為用供試品溶液制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值)，說明質(zhì)量濃度為8.0 g/L及以下時的供試品不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

表2 干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

根據(jù)干擾試驗(yàn)結(jié)果、細(xì)菌內(nèi)毒素限值和最小有效稀釋濃度，取3批注射用還原型谷胱甘肽鈉(每批各取6支)，稀釋成質(zhì)量濃度為4.0 g/L，分別使用廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠和湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)的鱟試劑(靈敏度λ均為0.5 EU/mL)，按2010年版《中國藥典(二部)》附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查，結(jié)果全部呈陰性。

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是否可行的先決條件是，樣品在滿足限量檢查要求的質(zhì)量濃度下對細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)不產(chǎn)生干擾。如果樣品在高質(zhì)量濃度時對細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)不產(chǎn)生干擾，則在低質(zhì)量濃度時也不產(chǎn)生干擾。在試驗(yàn)中，首先按照最小有效稀釋濃度，將樣品配制成質(zhì)量濃度分別為 4.0，2.0，1.0，0.5，0.25 g/L 的系列溶液，進(jìn)行干擾預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示均不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查，為了找出最大不干擾質(zhì)量濃度，進(jìn)一步對樣品質(zhì)量濃度分別為64.0，32.0，16.0，12.0，8.0 g/L 的系列溶液進(jìn)行干擾預(yù)試驗(yàn)，初步判斷最大不干擾質(zhì)量濃度為8.0 g/L。采用靈敏度 λ為0.5 EU/mL的鱟試劑對3個批號的樣品進(jìn)行了干擾確證試驗(yàn)，結(jié)果表明稀釋至8.0 g/L的樣品溶液對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用。因此，可以將注射用還原型谷胱甘肽鈉的細(xì)菌內(nèi)毒素限值 L定為0.125 EU/mg，選擇市售任意靈敏度的鱟試劑(0.5～0.03 EU/mL)，將樣品稀釋到相應(yīng)的質(zhì)量濃度(4.0～0.25 g/L)進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[4]。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅪE.

[2]張廣偉，周繼春.尼可剎米注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法的建立[J].中國藥業(yè)，2010，19(6):32－33

[3]李 浩，李健和，葉 清.尼扎替丁氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[J].中國藥業(yè)，2009，18(4):38－39.

[4]蔡 彤，張國來，李 波，等.84種注射用藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的方法學(xué)研究[J].中國藥學(xué)雜志，2010，45(2):150 －155.