魏振滿，丁晉彪，胡 琳，陳紅鴿，吳榮榮，劉萬卉，沙春潔

(1.中國人民解放軍302醫(yī)院臨床藥理室，北京 100039; 2.煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005)

石杉?jí)A甲是從天然植物千層塔中提取的生物堿，生物活性高，是一種對(duì)真性膽堿酯酶具有高度選擇性的可逆性膽堿酯酶抑制劑，主要用于治療良性記憶障礙及老年性癡呆[1]。將石杉?jí)A甲制成緩釋制劑，目的在于降低達(dá)峰血藥濃度，延長達(dá)峰時(shí)間，減少患者的服藥次數(shù)，減少不良反應(yīng)，提高患者的依從性和生活質(zhì)量，減輕患者家屬的負(fù)擔(dān)。筆者研究了石杉?jí)A甲緩釋片的生物利用度受飲食影響的程度，為臨床用藥提供參考。

1 儀器與試藥

API 4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有離子噴霧離子化源以及Analyst 1.4.1數(shù)據(jù)處理軟件(美國Applied Biosystem公司);Agilent 1100型高效液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司)。石杉?jí)A甲對(duì)照品(純度大于99%，山東綠葉制藥有限公司，批號(hào)為06020605);內(nèi)標(biāo)石杉?jí)A乙(純度大于99%，上海同田生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為06103101;甲醇(色譜純，Burdick＆Jackson公司)，其余試劑為分析純;空白血漿由煙臺(tái)市中心血站提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 受試者選擇

選擇12名受試者，男女各半;年齡20～30歲，平均(23±3)歲;體重指數(shù)為19～24;無藥物和食物過敏史，無心血管、呼吸、泌尿、消化道、內(nèi)分泌、神經(jīng)系統(tǒng)等病史;試驗(yàn)前2周內(nèi)未服任何其他藥物，3個(gè)月內(nèi)未參加過藥物臨床試驗(yàn)和獻(xiàn)血;無煙酒嗜好;體格檢查及實(shí)驗(yàn)室檢查(含血壓、心率、呼吸頻率、血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能、腎功能、心電圖、胸片)無異常;了解試驗(yàn)的目的、藥物性質(zhì)、可能風(fēng)險(xiǎn)以及自己的權(quán)益，并自愿簽署知情同意書。

2.2 給藥方案與血樣采集

本試驗(yàn)采用自身交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。12名健康受試者隨機(jī)進(jìn)入空腹給藥組和餐后給藥組，6名受試者空腹給予石杉?jí)A甲緩釋片200 μg;另外6名受試者進(jìn)食高脂、高蛋白食物，30 min后口服石杉?jí)A甲緩釋片200 μg。第1周期結(jié)束后，經(jīng)過7 d的清洗期，兩組受試者交換，進(jìn)行第2周期試驗(yàn)。12例受試者均完成全部試驗(yàn)。受試者于試驗(yàn)前1天晚20:00點(diǎn)前入Ⅰ期臨床試驗(yàn)病房，禁食不禁水約12 h;第2天早上8:00點(diǎn)左右服藥，于服藥前及服藥后0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，5，6，8，10，12，24，36，48 h 時(shí)從上肢肘靜脈取血 4 mL，置肝素抗凝管中放置1 h，以3000 r/min離心10 min，分離血漿，置－70℃下凍存，備用。受試者服藥及取血均在Ⅰ期臨床試驗(yàn)病房進(jìn)行，有主治醫(yī)師在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)施監(jiān)護(hù)。

2.3 血藥濃度測(cè)定

2.3.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱:Agilent Plus－C18柱(100 mm ×3.0 mm，3.6μm);流動(dòng)相:甲醇－水(80 ∶20，1 mmol/L 醋酸銨);流速:0.45 mL/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:10 μL。離子源:離子噴霧離子化源;離子噴射電壓:5500 V;溫度:550℃;源內(nèi)氣體1(GS1，N2)壓力:50 psi;氣體2(GS2，N2)壓力:55 psi;氣簾氣體(N2)壓力(CUR):15 psi;碰撞氣(CAD):10 psi;正離子方式檢測(cè);掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);石杉?jí)A甲和石杉?jí)A乙DP電壓分別為82，94 V，CE電壓分別為41，36 V，用于定量分析的離子反應(yīng)分別為 m/z 243.4→m/z 210.1和m/z 257.5→ m/z 198.0。

2.3.2 血樣處理

取200 μL血漿樣品，置10 mL具塞離心管中，加入100 μL甲醇－水(80∶20)混合溶劑，加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液(20 ng/mL石杉?jí)A乙)，100 μL 1 mol/L碳酸鈉，渦流混合2 min，加入3 mL正己烷－二氯甲烷 －異丙醇(2∶1∶0.1)混合溶劑，渦流混合 7 min，離心10 min(3600 r/min)，取上層有機(jī)相，置另一試管中，36℃空氣流下吹干，殘留物加入 100 μL流動(dòng)相(甲醇 －水，80∶20，1 mmol/L醋酸銨)溶解，渦流混合2 min，取10 μL進(jìn)行測(cè)定。

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性考察:分別取人空白血漿，按2.3.2項(xiàng)下方法操作，測(cè)得色譜圖1 A;將一定質(zhì)量濃度的石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)溶液和石杉?jí)A乙溶液加入空白血漿中，同法操作，測(cè)得色譜圖1 B;取受試者給藥后收集的血漿樣品，同法操作，測(cè)得色譜圖2 C。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾石杉?jí)A甲和石杉?jí)A乙的測(cè)定。

圖1 高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與定量下限確定:取人空白血漿200 μL，加入石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)系列溶液100 μL，配制成相當(dāng)于含石杉?jí)A甲血漿質(zhì)量濃度為 0.0500，0.200，1.00，2.50，5.00，12.5 ng/mL 的樣品，按2.3.2項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。以待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算[2]，求得回歸方程 Y=0.337 X+0.012，r=0.9985(n=6)。結(jié)果表明，石杉?jí)A甲質(zhì)量濃度線性范圍為0.0500～12.5 ng/mL，血漿樣品測(cè)定的定量下限為0.0500 ng/mL。

回收率試驗(yàn):取空白血漿200 μL，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與定量下限確定”項(xiàng)下方法制備低、中、高 3 個(gè)質(zhì)量濃度(0.100，2.00，10.0 ng/mL)的樣品，每一質(zhì)量濃度進(jìn)行6樣本分析，殘留物以流動(dòng)相溶解，進(jìn)樣分析。同時(shí)，另取空白血漿200 μL，按2.3.2項(xiàng)下方法操作，36℃空氣流下吹干，殘留物加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各100 μL，渦流混合，進(jìn)樣測(cè)定。低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度樣品的提取回收率分別為74.4%，68.7%，70.1%。

精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn):取空白血漿200 μL，按2.3.2項(xiàng)下方法配制低、中、高 3 個(gè)質(zhì)量濃度(0.100，2.00，10.0 ng/mL)的質(zhì)量控制樣品，每一質(zhì)量濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的濃度、準(zhǔn)確度與精密度。結(jié)果日內(nèi) RSD分別為7.5%，5.7%，4.7%(n=6);日間 RSD 分別為 9.0%，10.1%，2.9%(n=6)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):按“標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與定量下限確定”項(xiàng)下方法制備低、中、高 3 個(gè)質(zhì)量濃度(0.100，2.00，10.0 ng/mL)的樣品，共6個(gè)樣本，室溫下放置24 h重新進(jìn)樣，結(jié)果所有樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%，表明樣品在室溫放置24 h的穩(wěn)定性良好。取石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.100，2.00，10.0 ng/mL 各 100 μL，取 12 個(gè)樣本，空氣吹干后，加入200 μL空白血漿，其中6個(gè)樣本作為對(duì)照，另外6個(gè)樣本放于－35℃冰箱冷凍24 h，取出室溫融化，再放入冰箱冷凍2 h，取出于室溫融化后繼續(xù)放入冰箱中冷凍2 h，再取出室溫融化后，按2.3.2項(xiàng)下方法操作。結(jié)果所有樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于11.4%，表明血漿樣品可以進(jìn)行反復(fù)凍融，保障了整個(gè)分析過程中的數(shù)據(jù)真實(shí)、可靠。

2.3.4 未知血漿樣本的測(cè)定和質(zhì)量控制

按2.3.2項(xiàng)下方法操作，每批樣品制備一條工作曲線，同時(shí)制備低、中、高 3 個(gè)質(zhì)量濃度(0.10，2.00，10.00 ng/mL)的質(zhì)量控制樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)量控制樣品進(jìn)行雙樣本分析。根據(jù)每批的工作曲線計(jì)算質(zhì)量控制樣品和未知樣品的質(zhì)量濃度。上述質(zhì)量控制樣品中最多允許兩個(gè)樣品的質(zhì)量濃度超出理論值的15%(低質(zhì)量濃度點(diǎn)為20%)，否則此批數(shù)據(jù)不被接受。

2.4 血藥濃度－時(shí)間曲線繪制

根據(jù)測(cè)得的血藥濃度繪制藥－時(shí)曲線，12名受試者空腹及進(jìn)食后口服石杉?jí)A甲緩釋片平均血藥濃度－時(shí)間曲線見圖2。

圖2 石杉?jí)A甲平均血藥濃度－時(shí)間曲線

2.5 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算

采用DAS 2.0軟件的統(tǒng)計(jì)矩模型計(jì)算受試者口服石杉?jí)A甲緩釋片后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù);采用梯形法計(jì)算藥時(shí)曲線下面積(AUC)值，以半對(duì)數(shù)作圖法，由消除相的末端4個(gè)濃度點(diǎn)計(jì)算半衰期(t1/2)，達(dá)峰濃度(Cmax)和達(dá)峰時(shí)間(tmax)采用實(shí)測(cè)值。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1?？梢?，12名受試者進(jìn)食前后口服石杉?jí)A甲緩釋片主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)基本相似。

表1 12名受試者空腹和進(jìn)食后口服石杉?jí)A甲緩釋片的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.6 生物利用度分析

根據(jù) AUC0－t計(jì)算得到受試制劑的相對(duì)生物利用度平均為(97.5±10.8%)?？崭菇o藥 Cmax的置信區(qū)間為進(jìn)食后給藥相應(yīng)參數(shù)的76.6% ～87.6%(等效標(biāo)準(zhǔn)為70% ～143%)，說明 Cmax合格，沒有顯著性差異。tmax經(jīng)非參檢驗(yàn)得出 P＞0.05，說明 tmax沒有顯著性差異。

3 討論

本研究采用多級(jí)離子選擇性檢測(cè)，減少了血樣中雜質(zhì)對(duì)色譜峰的干擾，定量限達(dá)到0.02 ng/mL，操作簡便、快速、重現(xiàn)性好。因此，該法可用于大樣本量的石杉?jí)A甲血藥濃度的檢測(cè)及其藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度的研究。

本試驗(yàn)比較研究了石杉?jí)A甲緩釋片劑空腹及進(jìn)食后體內(nèi)石杉?jí)A甲的藥代動(dòng)力學(xué)特征，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)之間無顯著性差異，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[3－4];采用隨機(jī)雙交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方差分析法進(jìn)行分析，Cmax和 tmax經(jīng)非參檢驗(yàn)無顯著性差異(P＞0.05)。盡管進(jìn)食高脂肪、高蛋白食物不影響該藥的 tmax和 Cmax，但進(jìn)食后給藥較空腹給藥的 tmax和 Cmax有一定延后和增高，故推薦石杉?jí)A甲緩釋片劑飯前空腹服用。

[1]劉鐵薇.石杉?jí)A甲的藥理作用與臨床研究進(jìn)展[J].中藥材，2001，24(10):775－776.

[2]鐘大放.以加權(quán)最小二乘法建立生物分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的若干問題[J].藥物分析雜志，1996，16(5):343 －346.

[3]王 勇，周彥彬，田 娟，等.HPLC/MS/MS法測(cè)定人血漿中石杉?jí)A甲的濃度及人體相對(duì)生物利用度研究[J].中南藥學(xué)，2009，7(8):583－586.

[4]霍 強(qiáng)，李見春，高 署，等.LC/MS/MS法測(cè)定人血清中石杉?jí)A甲的濃度及應(yīng)用[J].中國新藥雜志，2009，18(11):1016－1026.