張立康，汪小珍，李婉姝，邱相君，孫 未，胡國新

(1.溫州醫(yī)學院藥學院，浙江溫州 325035;2.溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院，浙江溫州 325027;3.河南科技大學醫(yī)學院，河南洛陽 471003)

姜黃素(curcuminoids，Cur)是從姜科、天南星科中的一些植物的根莖中提取的一種化學成分，是植物界很稀少的具有二酮的色素［1］。姜黃素具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化、抗肝細胞毒性、抗風濕、抑菌等廣泛的藥理作用［2－4，9］。

姜黃素在水中溶解度低，血漿半衰期很短［5－6］，血藥濃度低，口服不易吸收，生物利用度低。而具有生物活性的化合物能否在生物體內發(fā)揮效應，很大程度上取決于血漿中藥物濃度和生物利用度。曾有文獻報道過姜黃素的口服生物利用度低，但缺乏其具體數(shù)據(jù)及其它給藥途徑的絕對生物利用度資料。本實驗測定不同給藥途徑下大鼠血漿中姜黃素的濃度，從而研究姜黃素的藥代動力學過程，計算口服以及腹腔注射姜黃素的生物利用度，為姜黃素不同劑型的制備以及臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀為Agilent1100系列，包括G1322A在線脫氣機，G1311A四元泵，G1313A自動進樣器，G1316A溫控箱，G1315B二極管陣列檢測器和 Agilent化學工作站(Rev B.08.04.［1757］)。電子分析天平(AB204-A，梅特勒-托利多上海儀器公司);渦旋混合器(XK96-B，姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司);氮吹儀(D10型，杭州藍焰科技有限公司)。

1.2 試劑和藥品 甲醇和乙腈為一級色譜純，三氟乙酸(Sigma，064K3647)，乙酸乙酯、氫氧化鈉均為分析純;實驗用水為娃哈哈純凈水。姜黃素對照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，含量 98.7%，070912);AF2364對照品(美國洛克菲勒大學提供，含量99.6%)。

1.3 動物 21只♂SD大鼠，體質量(230±20)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物許可證號:SCXK(滬)2007-0005。

2 方法

2.1 給藥方案

2.1.1 藥液的配制 灌胃給藥溶液:用5%DMSO-玉米油溶解，配制成200 mg·kg－1混懸液，臨用前配制。靜脈給藥溶液:用10%DMSO-生理鹽水溶解，配制成10 mg·kg－1澄清液，臨用前配制。腹腔注射給藥溶液:用10%DMSO-生理鹽水溶解，配制成20 mg·kg－1澄清液，臨用前配制。

2.1.2 給藥與樣品采集 將21只大鼠隨機分成3組，給藥前每組均禁食12 h(不禁水)，分別舌下靜脈(10 mg·kg－1)、灌胃(200 mg·kg－1)和腹腔注射(20 mg·kg－1)給藥。靜脈給藥后分別于5、8、10、15、20、25、35、45、60、120、180 min 尾靜脈取血;灌胃組分別于給藥后 10、15、25、35、45、60、120、180、240、300、360 min 尾靜脈取血;腹腔注射組分別于給藥后 10、15、25、35、45、60、120、180、240 min 尾靜脈取血。采血0.6 ml注入肝素化的試管，離心(3 000 r·min－1)取血漿，－40℃冰凍保存?zhèn)錅y。

2.2 對照品溶液的配制

2.2.1 對照品配制 準確稱取姜黃素標準對照品25 mg于25 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容至25 ml，得濃度為1 g·L－1的姜黃素標準儲備液;用甲醇稀釋成濃度依次為100、10、1 mg·L－1的標準工作液(臨用前稀釋)。

2.2.2 內標溶液的配制 準確稱取AF2364標準對照品25 mg于25 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容至25 ml，得濃度為1 g·L－1的 AF2364標準儲備液;用甲醇稀釋成濃度為100 mg·L－1的AF2364內標工作溶液。

2.3 血漿樣品處理 準確吸取待測血漿樣品0.3 ml于 10 ml具塞試管中，加入 100 mg·L－1的AF2364 內標工作液 50 μl，混勻后加入 0.01 mol·L－1氫氧化鈉溶液200 μl。再加入乙酸乙酯3.0 ml，漩渦混勻2 min。轉移上層有機相于另一刻度離心管中，氮吹儀中吹干。用200 μl流動相復溶，取復溶液于自動進樣器的樣品瓶中，設定10 μl進樣檢測。

2.4 色譜條件 色譜柱:ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent，USA);保護柱:SB-C18保護柱(4.6 mm × 12.5 mm，5 μm，Agilent，USA);流動相:乙腈 ∶水 ∶0.1%TFA=50∶30∶20(V/V/V);流速:1.0 ml·min－1;柱溫:35℃;檢測波長:302 nm(0～5.5 min)，422 nm(5.5～7.5 min)。

2.5 數(shù)據(jù)分析 采用DAS2.0藥動學軟件處理血藥濃度－時間數(shù)據(jù)，得到姜黃素的藥代動力學參數(shù)，并計算其腹腔注射和口服的絕對生物利用度。

3 結果

3.1 方法專屬性 空白血漿、姜黃素血漿標準品以及大鼠血漿樣品，經(jīng)HPLC分析測定得到的色譜圖見Fig 1。由圖可見在本實驗條件下，姜黃素與內標能完全分離，血漿中內源性物質不干擾姜黃素和內標的檢測;姜黃素的保留時間為6.7 min，內標的保留時間為4.4 min。

Fig 1 HPLC chromatograms of curcumin

3.2 線性關系及定量下限 配成濃度相當于0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 mg·L－1的姜黃素血漿標準品溶液，再按“2.3”項處理后檢測，測定姜黃素峰面積As、內標峰面積Ai，以As/Ai為縱坐標(Y)，以所對應各點濃度C為橫坐標(X)繪制標準曲線。得姜黃素的標準曲線回歸方程為^Y=0.3186X－0.0012(r=0.9998)。定量下限為0.05 mg·L－1(n=6;RSD=5.21%)。

3.3 回收率試驗

3.3.1 相對回收率試驗 配制低、中、高3種濃度(0.10、1.00、4.00 mg·L－1)的姜黃素血漿標準品溶液，每種濃度6份，再按“2.3”項處理后檢測。依據(jù)標準曲線計算各自的濃度，低、中、高3種濃度的相對回收率分別為(99.29±5.40)%、(104.21±4.72)%、(99.83±1.97)%。

3.3.2 絕對回收率試驗 配制低、中、高3種濃度(0.10、1.00、4.00 mg·L－1)的姜黃素血漿標準品溶液，每種濃度6份，再按“2.3”項處理后檢測，記錄姜黃素的峰面積，為血漿標準的峰面積。另取錐底試管6支，兩個一組;每組加入與配制血漿標準品溶液相同的姜黃素標準品溶液，直接吹干后用流動相200 μl復溶，10 μl進樣檢測;記錄不同濃度姜黃素的峰面積，為該濃度的純標準品的峰面積。計算血漿標準的峰面積與純標的峰面積的比值，即為絕對回收率，絕對回收率分別為(77.18±3.48)%、(77.84±1.22)%、(78.25±0.81)%。

3.4 精密度試驗 配制低、中、高3種濃度(0.10、1.00、4.00 mg·L－1)的姜黃素血漿標準品溶液，每種濃度6份，再按“2.3”項處理后于同一日內測定，依據(jù)當日標準曲線計算檢測量，計算日內精密度;連續(xù)3 d同樣操作，計算日間精密度。結果上述方法測得的日內和日間RSD均小于10%，符合生物分析方法指導原則的要求。

3.5 樣品穩(wěn)定性 配制低、中、高3個濃度(0.10、1.00、4.00 mg·L－1)的姜黃素血漿標準溶液，每種濃度3份;經(jīng)歷3次冰凍－解凍循環(huán)后，按“2.3”項處理檢測，考察其穩(wěn)定性。低、中、高3個濃度的RSD分別為4.92%、4.56%、0.65%，結果顯示凍融條件對血漿樣品的檢測結果沒有明顯的影響。

3.6 藥動學參數(shù)和絕對生物利用度 7只大鼠單劑量iv 10 mg·kg－1姜黃素后，血藥濃度－時間曲線見Fig 2A;7只大鼠單劑量ip 20 mg·kg－1姜黃素后，血藥濃度－時間曲線見Fig 2B;7只大鼠單劑量ig 200 mg·kg－1姜黃素后，血藥濃度－時間曲線見Fig 2C。

Fig 2 Mean concentration-time curve of Cur after a single dose of Cur with different administration

血漿藥物濃度經(jīng)DAS程序處理，姜黃素在大鼠體內iv、ip和ig給藥后的藥代動力學參數(shù)見Tab 1。并根據(jù)下式計算姜黃素在大鼠體內的絕對生物利用度:F/%=(AUC血管外給藥·D靜脈注射)/(AUC靜脈注射·D血管外給藥)×100%。經(jīng)計算姜黃素在大鼠體內，口服給藥絕對生物利用度為4.13%，腹腔注射給藥的絕對生物利用度為35.07%。

Tab 1Pharmacokinetic parameters of Cur in three groups(±s)

Tab 1Pharmacokinetic parameters of Cur in three groups(±s)

*P ＜0.05 vs iv(10 mg·kg－1)

Parameter iv/10 mg·kg－1 ip/20 mg·kg－1ig/200 mg·kg －1 T 1.64 ±0.49 10.55 ±0.74 13.16 ±2.17 T 12α/min 1 2 β/min 11.96±2.64 90.79±11.55* 159.28±18.12*V/L·kg－1 0.60±0.28 10.69±1.25 129.27±26.55 CL/L·h－1·kg－1 0.10±0.01 0.28±0.03 2.36±0.37 AUC(0－t)/mg·min·L －1 74.55±9.6 64.10±8.19 73.28±12.48 AUC(0－∞)/mg·min·L －1 104.62±11.89 73.39±8.72 86.36±12.90 Cmax/mg·min·L －1 3.61±0.47 0.95±0.08 0.70±0.050 Tmax/min 5 ±0 14.29 ±1.89 32.14 ±4.88

4 討論

4.1 液相色譜吸收波長的選擇 關于血漿姜黃素的檢測，一般采用 HPLC-UV的方法［7］。姜黃素在整個紫外區(qū)均有良好的吸收，二極管陣列檢測器(DAD)三維立體圖顯示，姜黃素的最大吸收波長在426 nm處。本研究使用AF2364做內標，最大吸收波長在302 nm處，故采用DAD波長梯度的功能，在0～5.5 min使用302 nm波長檢測 AF2364，5.5～7.5 min使用426 nm波長檢測姜黃素，獲得了良好的色譜峰。

4.2 藥動學特點 通過靜脈注射、腹腔注射和灌胃3種給藥途徑藥動學結果來看，姜黃素靜脈給藥后，大鼠體內代謝迅速。本實驗結果顯示姜黃素靜脈給藥的消除半衰期為(11.96±2.64)min，與灌胃給藥的消除半衰期(90.79±11.55)min、腹腔注射給藥的消除半衰期(159.28±18.12)min差異均有顯著性(P＜0.05)。同時從藥時曲線分布相可知，靜注后血藥濃度幾分鐘內就迅速下降了幾倍，這可能是姜黃素經(jīng)靜注后迅速向各臟器分布［8］。大鼠分別經(jīng)灌胃(200 mg·kg－1)、腹腔注射(20 mg·kg－1)、舌下靜脈(10 mg·kg－1)給予姜黃素后，其Cmax分別為(3.58 ±0.58)mg·L－1、(1.01 ±0.12)mg·L－1、(0.67 ±0.06)mg·L－1，可以為姜黃素在不同給藥途徑下的藥效學研究提供給藥劑量的參考。

4.3 絕對生物利用度 本實驗結果顯示，口服姜黃素的生物利用度達4.13%，腹腔注射姜黃素的生物利用度為35.07%，與文獻報道，姜黃素大鼠口服吸收很低［6］一致。腹腔給藥后，部分姜黃素未被吸收，可能與腹腔內的血流量有關，也可能是非水溶液在腹腔內局部滯留、吸收緩慢;腹腔給藥后的AUC明顯大于灌胃給藥AUC，說明姜黃素口服后極少原形吸收入血，可能是首過效應的影響或者是由于姜黃素的結構特點難以經(jīng)過腸道吸收。由于姜黃素口服生物利用度低，而腹腔注射生物利用度明顯高于口服，所以可以通過改變姜黃素的劑型，改為注射液，以增加其活性成分的吸收率。

［1］ Hong J，Bose M，Ju J，et al.Modulation of arachidonic acid metabolism by curcumin and related beta-diketone derivatives:effects on cytosolic phospholipase A(2)，cyclooxygenases and 5-lipoxygenase［J］.Carcinogenesis，2004，25(9):1671 －9

［2］ 許東暉，王 勝，金 晶，等.姜黃素的藥理作用研究進展［J］.中草藥，2005，36(11):1737 －9 .

［2］ Xu D H，Wang S，Jin J，et al.Advances in studies on pharmacological effect of curcumin［J］.Chin Trad Herb Drugs，2005，36(11):1737－9.

［3］ Strimpakos A S，Sharama R A.Curcumin:preventive and therapeutic properties in laboratory studies and clinical trails［J］.Antioxid Redox Signal，2008，10(3)511 －45.

［4］ Kurien B T，Singh A，Matsumoto H，et al.Improving the solubility and pharmacological efficacy of curcumin by heat treatment［J］.Assay Drug Dev Technol，2007，5(4):567 －76.

［5］ 韋曉瑜，陳世忠.姜黃素注射液在大鼠體內的藥代動力學［J］.北京大學學報(醫(yī)學版)，2003，35(3):230.

［5］ Wei X Y，Chen S Z.Study on pharmacokinetics of the curcumin injecta in rat［J］.Beijing Med Univ，2003，35(3):230.

［6］ Ireson C R，Jones D J，Orr S，et al.Metabolism of the cancer chemopreventive agent curcumin in human and rat intestine［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2002，11(1):105 －11.

［7］ 曾曉會，陳玉興，趙自明，等.姜黃素微囊在大鼠體內的藥代動力學研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16(2):107－10.

［7］ Ceng X H，Chen Y X，Zhao Z M，et al.Pharmacokinetics of curcumin microcystin in rats［J］.Chin J Exp Trad Med Form，2010，16(2):107－10.

［8］ 溫彩霞，許建華，黃秀旺.姜黃素在小鼠體內各臟器的藥代動力學研究［J］.中藥藥理與臨床，2007，23(4)25－6.

［8］ Wen C X，Xu J H，Huang X W.Pharmacokinetics of curcumin in mouse's visceral organs［J］.Pharmacol Clin Chin Mat Med，2007，23(4):25－6.

［9］ 雷軍榮，秦 軍，張 晶，等.姜黃素對大鼠缺血性腦損傷炎癥反應和血腦屏障通透性的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(1):120－3.

［9］ Lei R J，Qin J，Zhang J，et al.Effects of curcumin on inflammatory reaction and blood-brain barrier permeability in rats following cerebral ischemic injury［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):120－3.