馬偉英，何惠燕，紀(jì)風(fēng)濤，劉 玲，梁建軍，廣瀨宗孝，曹銘輝

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1.麻醉科、2.消毒供應(yīng)中心，廣東 廣州 510120;3.福井大學(xué)醫(yī)學(xué)部麻醉和復(fù)蘇科，福井910-1193，日本)

神經(jīng)源性疼痛是臨床上常見的難治性疼痛，目前尚沒有安全有效的藥物［1］。研究發(fā)現(xiàn)，局部或系統(tǒng)注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)可引起痛覺過敏和異常疼痛。NGF主要作用于其高親和力受體——酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TrkA)，增加TrkA磷酸化水平，致敏并上調(diào)傷害性感覺神經(jīng)元如瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1(Transient receptor potential vaniloid 1，TRPV1)，激活下游的傷害性因子，參與神經(jīng)源性疼痛形成，有研究表明給予NGF或TrkA拮抗劑可以阻斷這一過程，減輕神經(jīng)源性疼痛［2］。實(shí)驗(yàn)證明IPTRK3(一種新合成的細(xì)胞穿透肽)可以抑制NGF引起的PC12細(xì)胞TrkA磷酸化以及TRPV1的表達(dá)增加，但對(duì)與TrkA具有同源性的胰島素受體和表皮生長(zhǎng)因子受體磷酸化無明顯影響，是特異性的TrkA抑制劑［3］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)IPTRK3可明顯抑制背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)TRPV1 表達(dá)增加，減輕炎性疼痛［4］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎引起的神經(jīng)源性疼痛小鼠術(shù)后7 d腹腔單次注射IPTRK3可明顯緩解熱、機(jī)械痛覺過敏24 h［5］。Fos蛋白是原癌基因c-fos的表達(dá)產(chǎn)物，是檢測(cè)鎮(zhèn)痛藥物鎮(zhèn)痛效果的常用神經(jīng)元標(biāo)志物［6］。有研究表明在疼痛刺激之前給予鎮(zhèn)痛藥可以減輕手術(shù)刺激所致的中樞神經(jīng)元興奮，以達(dá)到術(shù)后鎮(zhèn)痛目的［7］。本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠神經(jīng)源性疼痛模型，術(shù)前單次腹腔注射IPTRK3，觀察IPTRK3對(duì)小鼠疼痛行為的治療作用，及對(duì)DRG內(nèi)TRPV1蛋白及脊髓背角Fos蛋白表達(dá)的影響，探討預(yù)先給予 IPTRK3治療神經(jīng)源性疼痛的效果及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 72只♂ ddy小鼠，體質(zhì)量25～35 g，由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，4只一籠，動(dòng)物在12:12 h的黑夜/白晝環(huán)境中飼養(yǎng)，避免強(qiáng)光及噪音刺激，自由攝取水和食物。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組(每組24只):①假手術(shù)組(sham):腹腔單次給予PBS，10 min后切開暴露坐骨神經(jīng)，然后依次縫合肌肉皮膚;② 部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎(partial sciatic nerve ligation，PSNL)組:腹腔單次給予PBS，10 min后行PSNL;③ IPTRK3組:腹腔單次給予 IPTRK3(10 mg·kg－1)，10 min后行 PSNL術(shù)。各組隨機(jī)取12只小鼠于不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)疼痛行為學(xué)，隨機(jī)取6只于術(shù)后2 h取新鮮的L4-5DRG用Western blot檢測(cè)DRG內(nèi)TRPV1蛋白表達(dá)水平變化，其余6只于術(shù)后2 h灌流，取脊髓用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)脊髓背角Fos陽性神經(jīng)元的數(shù)目。

1.2 試劑材料 IPTRK3由日本大阪肽研究所合成;七氟醚(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司);多克隆兔抗Fos抗體(Calbiochem，Darmstadt，德國(guó));多克隆兔抗TRPV1(Neromics，Edina，MN，美國(guó));羊抗兔 HRP IgG 二抗(Vector Laboratories，Burlingame，CA，美國(guó));痛行為測(cè)定儀(Ugo Basile，Comerio，意大利)。

1.3 動(dòng)物模型制作 參照Seltzer等［8］的方法:小鼠采用5%七氟醚誘導(dǎo)30 s，2%的七氟醚維持麻醉，手術(shù)過程約3～5 min。在無菌操作下，股段高位暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)。在坐骨神經(jīng)干向后二頭肌和半腱肌分支處的遠(yuǎn)端小心地將神經(jīng)背側(cè)與周圍組織分離，用小止血鉗夾住神經(jīng)背側(cè)，將一條8-0號(hào)硅制絲線縫入神經(jīng)干內(nèi)，結(jié)扎神經(jīng)背側(cè)1/3～1/2。sham組只作暴露坐骨神經(jīng)，不予結(jié)扎。依次縫合皮膚肌肉。

1.4 疼痛行為學(xué)測(cè)量 小鼠分別于給藥前(pre)和給藥后 2、8、24、48、72 h測(cè)定左后爪的熱敏縮足反射閾值(paw withdrawal latency，PWL)和機(jī)械刺激縮足反射閾值(paw withdrawal threshold，PWT)。PWL:儀器發(fā)射紅外光(落在足底的光圈直徑為5 mm)照射小鼠左足底，安靜小鼠逃避性抬腿時(shí)，記錄開始照射至出現(xiàn)縮足逃避反射時(shí)間(s)。重復(fù)3次，間隔10 min，取平均值用于統(tǒng)計(jì)分析。為防止小鼠足底灼傷，紅外光照射最長(zhǎng)時(shí)間設(shè)為20 s。PWT:采用足底機(jī)械痛敏測(cè)定儀測(cè)定各組小鼠PWT值，于安靜小鼠左后足底加壓至逃避性抬腿，記錄開始加壓至出現(xiàn)縮足逃避反射壓力數(shù)值(g)，重復(fù)3次，間隔10 min，取平均值。

1.5 TRPV1蛋白印跡法 乙醚麻醉后，迅速打開椎管，取左側(cè)L4～L5背根神經(jīng)節(jié)，立即置入液氮中保存。向組織中加入蛋白裂解液(1 ml蛋白裂解液加10 μl蛋白酶抑制劑)，超聲裂解組織，低溫離心機(jī)中15 000×g離心30 min取上清。BCA法測(cè)定樣品的蛋白含量，用8%SDS-聚丙酰胺凝膠分離蛋白，30 μg/well樣品蛋白100 V電泳。然后將蛋白轉(zhuǎn)移到 NC膜，轉(zhuǎn)膜電壓為100 V，時(shí)間90 min。5%的脫脂奶粉溶液封閉1 h，多克隆兔抗TRPV1(1∶2 000)4℃孵育過夜，TBST緩沖液沖洗3次，HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液沖洗3次，ECL曝光，高敏感X線片顯色。同樣方法測(cè)定內(nèi)參βactin蛋白表達(dá)。用program Image J(version 1.35)進(jìn)行相對(duì)灰度值分析。

1.6 Fos蛋白免疫組織細(xì)胞化學(xué)染色法 采用乙醚麻醉，經(jīng)左心室灌流固定。先用50 ml生理鹽水快速灌流沖洗血液，繼以4%多聚甲醛30 ml持續(xù)灌注。取出L4～L5段脊髓，4%多聚甲醛后固定4～8 h，然后20%蔗糖脫水，置4℃冰箱過夜。冰凍連續(xù)切片(片厚 40μm)隔5取1，收集在 0.01 mol·L－1PBS緩沖液中。1%H2O2處理30 min，漂洗后5%正常山羊血清封閉1 h，浸入Fos一抗(1∶20 000)，室溫過夜。漂洗后浸入HRP IgG二抗(1∶600)，孵育1 h。漂洗后浸入 ABC復(fù)合物，孵育30 min。DAB顯色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。細(xì)胞中有棕褐色或棕黃色顆粒沉積，無論染色深淺，即為Fos陽性細(xì)胞。每只小鼠隨機(jī)抽取4張切片計(jì)數(shù)，取其平均值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD法。不服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用多組樣本的秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠熱敏、機(jī)械縮足反射閾值的變化 各組小鼠術(shù)前基礎(chǔ)值及sham組各時(shí)間點(diǎn)的PWL和PWT之間無差異(P＞0.05)。與sham組相比，PSNL組PWL和 PWT于術(shù)后2 h即出現(xiàn)明顯降低(P＜0.05)。IPTRK3組PWL和PWT比PSNL組明顯增高，并持續(xù)至術(shù)后72 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見 Fig 1。

Fig 1 Effects of intraperitoneal(ip)injections of IPTRK3 on PSNL-induced thermal and mechanical hyperalgesia(±s，n=12)

2.2 DRG內(nèi)TRPV1蛋白的表達(dá)變化 與sham組相比，PSNL組DRG中TRPV1蛋白表達(dá)水平明顯增高。IPTRK3組 TRPV1蛋白含量比PSNL組明顯降低(P＜0.05)，但仍明顯高于 sham組(P＜0.05)。見 Fig 2。

Fig 2 Effects of ip injections of IPTRK3 on the up-regulation expression of TRPV1 in DRG induced by PSNL(±s，n=6)

2.3 脊髓背角Fos蛋白的表達(dá)變化 與sham組相比，PSNL組脊髓背角淺層和深層Fos陽性神經(jīng)元數(shù)目均明顯增加(P＜0.05)。與 PSNL組相比，IPTRK3組脊髓背角淺層和深層 Fos陽性神經(jīng)元明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見Fig 3，4。

Fig 3 Effects of ip injections of IPTRK3 on increasing protein expression of Fos in the spinal dorsal horn induced by PSNL

3 討論

因神經(jīng)源性疼痛發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)有的藥物尚不能明顯緩解神經(jīng)源性疼痛患者的疼痛癥狀，因此尋找新的藥物作用靶點(diǎn)、探索新的鎮(zhèn)痛藥物對(duì)治療神經(jīng)病理性疼痛具有重要意義。在臨床上，病人術(shù)后的慢性神經(jīng)疼痛通常是由急性的手術(shù)疼痛和圍術(shù)期神經(jīng)損傷引起的。有研究表明在組織損傷之前給予鎮(zhèn)痛藥物對(duì)于術(shù)后疼痛是有效的，其主要通過減少有害刺激傳入所導(dǎo)致的外周和中樞敏感化，以抑制神經(jīng)可塑性變化，從而達(dá)到創(chuàng)傷后鎮(zhèn)痛和減少鎮(zhèn)痛藥用量的目的［7］。我們的研究發(fā)現(xiàn)預(yù)先單次腹腔注射細(xì)胞穿透肽IPTRK3 10 mg·kg－1明顯減輕PSNL引起的痛覺過敏，而且這種鎮(zhèn)痛作用可持續(xù)至術(shù)后72 h，先前的研究在PSNL后7 d單次腹腔給予IPTRK3，鎮(zhèn)痛作用僅可持續(xù) 24 h［5］，這些結(jié)果提示神經(jīng)損傷前預(yù)先給予IPTRK3鎮(zhèn)痛效果較術(shù)后給藥持久。

Fig 4 Effects of ip injections of IPTRK3 on the expression and distribution of Fos-positive neurons in the L4-L5segments of the laminaeⅠ-ⅡandⅢ-Ⅳ(±s，n=6)

既往研究發(fā)現(xiàn)對(duì)非甾體類或阿片類等傳統(tǒng)鎮(zhèn)痛藥物治療效果不佳的某些疼痛狀態(tài)，NGF拮抗劑或TrkA抑制劑具有明顯的治療效果［2］，但是這些藥物往往作用時(shí)間較短，需要重復(fù)給藥［9］，或者對(duì)TrkA缺乏特異性，副作用較大［10］。因此，我們?nèi)斯ず铣闪薎PTRK3，結(jié)構(gòu)為 YGRKKRRQRRR-acp-SRDIYSTDYYR。其中47-YGRKKRRQRRR-57是建立在人類免疫缺陷病毒1型基礎(chǔ)上，可以使IPTRK3穿透細(xì)胞膜，與作用靶點(diǎn)更好的結(jié)合;而666-SRDIYSTDYYR-676是可與 TrkA結(jié)合的氨基酸序列激活環(huán)，使IPTRK3可以特異性抑制TrkA的活性。細(xì)胞試驗(yàn)也已經(jīng)證實(shí)IPTRK3可以特異性抑制 TrkA的活性，而且無明顯細(xì)胞毒性［3］。NGF是一種親神經(jīng)性因子，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中參與中樞和周圍神經(jīng)的發(fā)育、存活和維持。但在成熟的機(jī)體NGF表達(dá)增加并激活其受體TrkA卻是誘發(fā)痛覺過敏的重要原因之一。NGF結(jié)合細(xì)胞膜上的TrkA受體后，首先激活局部的TRPV1使神經(jīng)元興奮性增加，然后啟動(dòng)酪氨酸激酶信號(hào)傳遞系統(tǒng)，迅速使細(xì)胞內(nèi)TRPV1、P物質(zhì)、BDNF等蛋白表達(dá)增加，放大疼痛效應(yīng)［2］。TRPV1主要分布于背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)中的中、小直徑神經(jīng)元，是初級(jí)感覺神經(jīng)元外周末端傷害性刺激的分子整合者。TRPV1可被傷害性熱刺激(＞42℃)、炎癥介質(zhì)(緩激肽、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、組胺)、香草素類化合物(如辣椒堿、RTX)等激活［11］。激活的TRPV1可使鈣離子內(nèi)流，神經(jīng)元去極化，產(chǎn)生動(dòng)作電位，參與痛覺過敏的形成［12］。NGF作用于體外培養(yǎng)的DRG可明顯增強(qiáng)辣椒素誘導(dǎo)的TRPV1活性［13］。本研究結(jié)果顯示預(yù)先給予IPTRK3后DRG內(nèi)TRPV1蛋白表達(dá)程度與單純手術(shù)組相比明顯降低，表明IPTRK3的使用可抑制神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的DRG內(nèi)TRPV1的表達(dá)增加。上述結(jié)果提示IPTRK3可能通過抑制TrkA活性，減少TRPV1的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)，降低神經(jīng)元的興奮性，從而達(dá)到抑制痛覺過敏的作用。

c-fos是一種即刻早期基因，外周傷害性刺激可迅速誘導(dǎo)脊髓內(nèi)Fos表達(dá)增多，是檢測(cè)鎮(zhèn)痛藥物鎮(zhèn)痛效果的常用神經(jīng)標(biāo)志物。有研究證明坐骨神經(jīng)部分損傷后1.5～2 h，F(xiàn)os蛋白表達(dá)達(dá)到高峰，5 d恢復(fù)正常［14］。而使用TrkA抑制劑A77-1726可明顯阻斷IL-13介導(dǎo)c-fos表達(dá)［15］。本實(shí)驗(yàn)中腹腔預(yù)先給予TrkA抑制劑IPTRK3后2 h已有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，因此選擇PSNL術(shù)后2 h的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)Fos蛋白表達(dá)的改變。發(fā)現(xiàn)PSNL術(shù)后Fos蛋白表達(dá)明顯增加，且主要分布于脊髓Ⅰ～Ⅱ，而給予 IPTRK3后，明顯抑制PSNL誘導(dǎo)脊髓背角淺層Fos蛋白的表達(dá)增加。脊髓背角淺層多為傷害性刺激傳入纖維終末，提示除了外周感覺神經(jīng)系統(tǒng)，在脊髓水平IPTRK3也可以抑制疼痛信號(hào)的傳遞，從而產(chǎn)生迅速明顯的抗傷害作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，預(yù)先給予IPTRK3減輕PSNL動(dòng)物疼痛行為的表現(xiàn)，對(duì)神經(jīng)病理性疼痛具有一定的治療作用。其機(jī)制可能是通過抑制TrkA激活、減少DRG內(nèi)TRPV1蛋白及脊髓背角Fos蛋白的表達(dá)，從外周和中樞同時(shí)抑制傷害性刺激信息傳遞從而發(fā)揮迅速的鎮(zhèn)痛作用。

［1］ O'Connor A B.Neuropathic pain:a review of the quality of life impact，costs，and cost-effectiveness of therapy［J］.Pharmacoeconomics，2009，27(2):95 －112.

［2］ Hefti F F，Rosenthal A，Walicke P A，et al.Novel class of pain drugs based on antagonism of NGF［J］.Trends Pharmacol Sci，2006，27(2):85－91.

［3］ Hirose M，Takatori M，Kuroda Y，et al.Effect of synthetic cellpenetrating peptide on TrkA activity in PC12 cells［J］.J Pharmacol Sci，2008，106(1):107 －13.

［4］ Ueda K，Hirose M，Murata E，et al.Local administration of a synthetic cell-penetrating peptide antagonizing TrkA function suppresses inflammatory pain in rats［J］.J Pharmacol Sci，2010，112(4):438－43.

［5］ Ma W Y，Murata E，Ueda K，et al.A synthetic cell-penetrating peptide antagonizing TrkA function suppresses neuropathic pain in mice［J］.J Pharmacol Sci，2010，114(1):79 － 84.

［6］ Harris J A.Using c-fos as a neural marker of pain［J］.Brain Res Bull，1998，45:1 －8.

［7］ Cheng K I，Lai C S，Wang F Y，et al.Intrathecal lidocaine pretreatment attenuates immediate neuropathic pain by modulating Nav1.3 expression and decreasing spinal microglial activation［J］.BMC Neurol，2011，11(1):71.

［8］ Seltzer Z，Dubner R，Shir Y.A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury［J］.Pain，1990，43(2):205－18.

［9］ Watson J J，F(xiàn)ahey M S，van den Worm E，et al.TrkAd5:a novel therapeutic agent for treatment of inflammation pain and asthma［J］.J Pharmacol Exp Ther，2006，316(3):1122 －9.

［10］Winston J H，Toma H，Shenoy M，et al.Acute pancreatitis results in referred mechanical hypersensitivity and neuropeptide up-regulation that can be suppressed by the protein kinase inhibitor K252a［J］.J Pain，2003，4(6):329 －37.

［11］王 樂，王蘭蘭，曹 宇.TRPVl對(duì)LPS致熱大鼠體溫及下丘腦中Ca2+濃度和cAMP含量的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(1):51－5.

［11］ Wang L，Wang L L，Cao Y.Effect of TRPV1 on LPS-induced fever and the content of Ca2+and camp in hypothalamus in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(1):51 －5.

［12］王 樂，曹 宇.TRPV1阻斷劑的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志，2008，28(3):220－4.

［12］ Wang L，Cao Y.Progress in vaniloid receptor1antagonist［J］.Int J Pathol Clin Med，2008，28(3):220－4.

［13］ Bonnington J K，McNaughton P A.Signalling pathways involved in the sensitisation of mouse nociceptive neurones by nerve growth factor［J］.J Physiol，2003，551:433 －46.

［14］ Li X，Clark J D.Heme oxygenase type 2 participates in the development of chronic inflammatory and neuropathic pain［J］.J Pain，2003，4(2):101－7.

［15］石小玉，龔妍春，李文林，等.酪氨酸激酶抑制劑A77-1726阻斷IL-13介導(dǎo)STAT6磷酸化和c-fos表達(dá)［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(7):906－10.

［15］ Shi X Y，Gong Y C，Li W L，et al.Tyrosine kinase inhibitor A77-1726 inhibiting STAT6 phosphorylation and c-fos expression induced by IL-13［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(7):906 －10.