鐘詩龍，伍 虹，楊 敏，劉曉穎，鄭志偉，林秋雄，符永恒，麥麗萍，周志凌，余細勇

(1.廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，2.廣東省心血管病研究所，3.廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院廣東省臨床藥理研究所，廣東廣州 510120，4.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 510080)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是引起致殘致死的重要原因。MI后出現(xiàn)以左心室肥大，左心室收縮功能障礙以及左心室纖維化為特征的心臟重構(gòu)(cardiac ventricular remodeling，VR)，它是發(fā)生慢性心力衰竭(CHF)的主要病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重地影響MI的預(yù)后，所以必須積極預(yù)防心臟重構(gòu)，才能提高MI后的生存質(zhì)量。逆轉(zhuǎn)左心臟重構(gòu)是目前心血管疾病治療的重要課題［1］。目前已知MI后，許多因素，包括交感神經(jīng)和腎素血管緊張素系統(tǒng)(rennin angiotensin system，RAS)的激活、炎性細胞因子的作用、氧化應(yīng)激及細胞凋亡的發(fā)生，都參與了調(diào)控心臟重構(gòu)。其中RAS在心梗后心臟重構(gòu)中起著重要的作用，而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶1(ACE1)和ACE2平衡在CHF的發(fā)病機制及其治療中具有極其重要作用［1］，然而它們的上游調(diào)控機制還不清楚。

本研究擬采用權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析方法(WGCNA)挖掘從NCBI的GEO下載2個心肌梗死后心臟重構(gòu)的全基因組表達數(shù)據(jù)，研究心肌梗死后心臟重構(gòu)的權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，識別心臟重構(gòu)的相關(guān)模塊及其關(guān)鍵調(diào)控基因，闡明這些模塊在心肌梗死后心臟重構(gòu)中相對重要性及其網(wǎng)絡(luò)關(guān)系;并研究關(guān)鍵調(diào)控基因與ACE1和ACE2的關(guān)聯(lián)性，為ACE1和ACE2的上游調(diào)控機制提供研究基礎(chǔ)，為心臟重構(gòu)治療提供靶點。

權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析是一種新開發(fā)的強大的用于解析分子作用機制和網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的系統(tǒng)生物學(xué)方法［2］。權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析方法自誕生以來被成功應(yīng)用于多種生物環(huán)境，并取得了許多重要發(fā)現(xiàn)［3－6］。這一新的研究方法為我們揭示心臟重構(gòu)的分子機制提供了銳利的武器。

1 方法

1.1 GEO全基因組表達數(shù)據(jù) 從NCBI的GEO下載2個心肌梗死后心臟重構(gòu)的全基因組表達數(shù)據(jù)GSE7487［7］和 GSE738［8］。GSE7487 發(fā)表于 2010 年3月，在設(shè)計上，3－4月的小鼠通過結(jié)扎左前降支造成心肌梗死模型制備心肌重構(gòu)模型，對照為假手術(shù)模型，飼養(yǎng)8周后處死收集左室心肌組織，提取mR-NA，用Affymetrix Mouse Genome 430 2.0芯片檢測全基因組基因表達。GSE738發(fā)表于2004年3月，在設(shè)計上，大鼠通過結(jié)扎左前降支造成心肌梗死模型制備心肌重構(gòu)模型，對照為假手術(shù)模型，飼養(yǎng)3～9周后處死收集無梗死斑的左室心肌組織(本研究只取9周時的數(shù)據(jù))，提取mRNA，用Affymetrix大鼠RGU34A芯片檢測全基因組基因表達。

1.2 心肌梗死后心臟重構(gòu)的WGCNA及關(guān)鍵調(diào)控基因識別 WGCNA是一個系統(tǒng)生物學(xué)分析方法，主要途徑如下。①基因表達數(shù)據(jù)初處理:對基因表達數(shù)據(jù)作背景校正和標(biāo)準(zhǔn)化后，濾過異常和變異小的基因，濾過標(biāo)準(zhǔn)如下:平均表達量與中位數(shù)表達量比值＞5的基因;至少有一個表達量＞30 000的基因;平均表達量排在50%以后及表達變異排在50%以后的基因。②構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò):我們用基因共表達相似性來定義網(wǎng)絡(luò)。如果用sij來表示一對基因i和j的基因共表達相似性，那么我們可以用冪鄰接函數(shù)的方法把相關(guān)性轉(zhuǎn)化基因的鄰接關(guān)系:(Sij)signed=(1+cor(xi，xj))/2。在數(shù)據(jù)處理時，先對全基因組基因表達數(shù)據(jù)作初步濾過，然后用Pearson相關(guān)性測量基因表達譜的一致性，最后用冪鄰接函數(shù)的方法把Pearson相關(guān)矩陣轉(zhuǎn)化成權(quán)重共表達網(wǎng)絡(luò)。③網(wǎng)絡(luò)模塊(Module)分析:網(wǎng)絡(luò)模塊是指相互緊密關(guān)聯(lián)的基因的組合。在模塊檢測時，首先將上述鄰接行列矩陣(它是拓撲結(jié)構(gòu)相似性的度量)轉(zhuǎn)化成拓撲結(jié)構(gòu)的不相似性，再用聚類分析檢測模塊。然后用t檢驗分析基因重要性來確定模塊是否與心臟重構(gòu)有關(guān)聯(lián)。④模塊向量基因(Eigengene):模塊向量基因指模塊表達矩陣的第一主成分基因。它被認為模塊中最具代表性的基因，因而有重要生物學(xué)意義。模塊向量基因可以通過對表達數(shù)據(jù)的奇異值分解得到(X=UDVT)，X是指定模塊的基因表達數(shù)據(jù)，V1表示模塊向量基因。向量基因網(wǎng)絡(luò)是一個非常有效的研究系統(tǒng)生物學(xué)的工具。⑤模塊聯(lián)盟(module membership，MM)分析和關(guān)鍵調(diào)控基因(hub genes)識別:通過計算基因i與模塊內(nèi)的向量基因的關(guān)聯(lián)得到模塊聯(lián)盟:MM(i)=|cor(x(i)，ME)|。我們主要考慮MM值，然后考慮基因重要性確定關(guān)鍵調(diào)控基因。⑥特異信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析與可視化:用VisAnt程序分別對重要模塊的基因作信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析和可視化分析。⑦ 采用DAVID功能注釋生物信息學(xué)芯片分析系統(tǒng)對與心臟重構(gòu)相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)模塊基因進行基因富集分析。

1.3 關(guān)鍵調(diào)控基因與ACE1和ACE2的關(guān)聯(lián)性分析 Student’s T檢驗分析關(guān)鍵調(diào)控基因、ACE1和ACE2在心臟重構(gòu)與假手術(shù)組之間的差異。用線性回歸分析關(guān)鍵調(diào)控基因RCAN1與ACE1和ACE2的關(guān)聯(lián)性。

1.4 驗證大鼠心肌梗死模型的建立 按本課題組發(fā)表的方法建立急性心肌梗死后心臟重構(gòu)大鼠模型［9］。假結(jié)扎組大鼠操作步驟同上，開胸過線只留線不結(jié)扎。模型大鼠和對照大鼠飼養(yǎng)6周后分析心臟重構(gòu)的指標(biāo)，處死收集左室心肌組織、觀察心臟形態(tài)改變并作病理學(xué)分析。

1.5 RT-qPCR檢測基因表達 從梗死模組大鼠心肌梗死區(qū)和假手術(shù)組大鼠相應(yīng)心肌區(qū)域提取RNA，用RT-qPCR檢測RCAN1與ACE1和ACE2基因表達。用Student's T檢驗分析關(guān)鍵調(diào)控基因、ACE1和ACE2在心臟重構(gòu)與假手術(shù)組之間的差異。用線性回歸分析關(guān)鍵調(diào)控基因RCAN1與ACE1和ACE2的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果

2.1 GE O全基因組表達數(shù)據(jù)基本信息 在GSE7487全基因組表達數(shù)據(jù)中，模型組與對照組各包括12個數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)用MAS5作基因表達數(shù)據(jù)作背景校正和標(biāo)準(zhǔn)化，下載數(shù)據(jù)包括45 037個基因探針。在本研究中，每個探針看作一個基因。在構(gòu)建基因共表達模塊與網(wǎng)絡(luò)時，為了減輕噪音和減輕計算機的運算負擔(dān)，需對數(shù)據(jù)作初處理，首先濾過變異小的基因、異常數(shù)據(jù)，然后濾過與其他基因相關(guān)性小的基因，最后保留6 846個基因。

在GSE738全基因組表達數(shù)據(jù)中，模型組與對照組各包括6個數(shù)據(jù)。Affymetrix大鼠RGU34A芯片包括8 740個基因(包括59個質(zhì)控基因，在分析中去除)。數(shù)據(jù)作初處理按照上述數(shù)據(jù)處理方法。

2.2 心肌梗死后心臟重構(gòu)的權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡(luò)模塊 用GSE7487全基因組表達數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示小鼠心肌梗死后心臟重構(gòu)有17個網(wǎng)絡(luò)模塊。這些模塊是通過用基于拓撲結(jié)構(gòu)重疊的不相似性的聚類方法分析來檢測到，如圖1A所示，每一個模塊用一種顏色來表示。用GSE738全基因組表達數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示大鼠心肌梗死后心臟重構(gòu)也有17個網(wǎng)絡(luò)模塊，如Fig 1B所示。

在17個小鼠心肌梗死后心臟重構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)模塊中有6個模塊與心臟重構(gòu)相關(guān)，見Fig 1C。在17個大鼠心肌梗死后心臟重構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)模塊中有5個模塊與心臟重構(gòu)相關(guān)，見Fig 1D。

2.3 DAVID信號通路富集分析 用DAVID功能注釋生物信息學(xué)芯片分析系統(tǒng)進一步對與小鼠心肌梗死后心臟重構(gòu)相關(guān)的6個模塊進行KEGG信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)模塊基因富集于16條KEGG信號通路。對與大鼠心肌梗死后心臟重構(gòu)相關(guān)的5個模塊進行KEGG信號通路富集分析，模塊基因富集于15條KEGG信號通路，其中有10條信號通路與第1組數(shù)據(jù)結(jié)果相同，這些信號通路涉及心肌肥厚病理、氧化磷酸化、代謝等。結(jié)果見Tab 1。兩組數(shù)據(jù)結(jié)果的高度一致顯示W(wǎng)GCNA方法的健壯性和準(zhǔn)確性。

Fig 1 Network module identification and gene significance analysis of cardiac remodeling after myocardial infarction by WGCNA

2.4 心臟重構(gòu)的關(guān)鍵調(diào)控基因 通過比較模塊內(nèi)連通性和基因重要性可以幫助找到一些心臟重構(gòu)的關(guān)鍵調(diào)控基因。在模塊中與其他基因關(guān)聯(lián)性越多的基因，往往在模塊中的作用越重要，如Fig 2A顯示黑色模塊中在右上角的基因既與其他基因相關(guān)性大、又對心臟重構(gòu)的重要性大。特別關(guān)注模塊內(nèi)連通性最大的30個基因，用VisAnt程序分別對重要模塊的基因作信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析和可視化分析顯示鈣依賴磷酸酶調(diào)節(jié)子(RCAN1)是心臟重構(gòu)的一個關(guān)鍵調(diào)控基因。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可視化見Fig 2B。

2.5 關(guān)鍵調(diào)控基因RCAN1與ACE1和ACE2的關(guān)聯(lián)性分析 因為ACE1在慢性心力衰竭的發(fā)病機制及其治療中有極其重要作用，因此我們對關(guān)鍵調(diào)控基因RCAN1與ACE1和ACE2的關(guān)聯(lián)性進行分析。Student's T檢驗分析表明關(guān)鍵調(diào)控基因RCAN1與ACE1在心臟重構(gòu)中表達升高，而ACE2在心臟重構(gòu)與假手術(shù)組之間無差異。線性回歸分析表明RCAN1表達與ACE1表達高度相關(guān)。在動物模型中驗證結(jié)果與上述結(jié)果一致，ACE1在心臟重構(gòu)中表達增加，并與RCAN1表達呈正相關(guān)(r=0.749，P＜0.001);而 ACE2表達基本沒改變，與RCAN1表達無關(guān)聯(lián)(r=0.144，P=0.532)。

3 討論

在本研究中，通過權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析方法分別對2個心肌梗死后心臟重構(gòu)的全基因組表達數(shù)據(jù)進行分析，成功識別心肌梗死后心臟重構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)模塊，小鼠與大鼠的心臟重構(gòu)的信號通路基本相似，這些信號通路涉及心肌肥厚病理、氧化磷酸化、代謝等。值得注意的是幾條與神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)的信號通路明顯富集，如帕金森癥、阿爾采末癥、亨廷頓舞蹈癥相關(guān)通路，這提示心肌重構(gòu)與神經(jīng)重構(gòu)有一定關(guān)聯(lián)。

進一步利用模塊內(nèi)連通性和基因重要性找到了一些心臟重構(gòu)的關(guān)鍵調(diào)控基因，如鈣依賴磷酸酶調(diào)節(jié)子(RCAN1)。RCAN1表達與ACE1表達在心臟重構(gòu)中均表達增加，且高度相關(guān)，而ACE2表達基本沒改變。這種相關(guān)性在我們建立的大鼠心肌梗死模型中得到驗證。由此可見心臟重構(gòu)中RAS系統(tǒng)中的ACE1－ACE2已經(jīng)失去平衡，這可能是心臟重構(gòu)的一個重要機制。為了彌補失去平衡的ACE1－ACE2系統(tǒng)，提高ACE2的活性也許是治療心衰的一個重要手段。最近研究發(fā)現(xiàn)，ACE2表達增加可以減輕大鼠心梗模型心肌重構(gòu)和心功能失調(diào)［10］。RCAN1作為心臟重構(gòu)的關(guān)鍵調(diào)控基因可能是ACE1的上游調(diào)控機制，但這需要進一步研究驗證。

Fig 2 Relationship of module membership with gene significance(A)and pathway visualization of 30 genes with the highest module membership.

Tab 1 Gene enrichment analysis of KEGG pathway

［1］ Oudit G Y，Penninger J M.Recombinant human angiotensin-converting enzyme 2 as a new Renin-Angiotensin system peptidase for heart failure therapy［J］.Curr Heart Fail Rep，2011，8(3):176 －83.

［2］ Langfelder P，Horvath S.WGCNA:an R package for weighted correlation network analysis［J］.BMC Bioinformatics，2008，9:559.

［3］ Mason M J，F(xiàn)an G，Plath K，et al.Signed weighted gene co-expression network analysis of transcriptional regulation in murine embryonic stem cells［J］.BMC Genomics，2009，10:327.

［4］ Oldham M C，Konopka G，Iwamoto K，et al.Functional organization of the transcriptome in human brain［J］.Nat Neurosci，2008，11(11):1271－82.

［5］ Liao Q，Liu C，Yuan X，et al.Large-scale prediction of long noncoding RNA functions in a coding-non-coding gene co-expression network［J］.Nucleic Acids Res，2011，39(9):3864 － 78.

［6］ Plaisier C L，Horvath S，Huertas-Vazquez A，et al.A systems genetics approach implicates USF1，F(xiàn)ADS3，and other causal candidate genes for familial combined hyperlipidemia［J］.PLoS Genet，2009，5(9):e1000642.

［7］ Lin R C，Weeks K L，Gao X M，et al.PI3K(p110 alpha)protects against myocardial infarction-induced heart failure:identification of PI3K-regulated miRNA and mRNA［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30(4):724 －32.

［8］ Strom C C，Kruhoffer M，Knudsen S，et al.Identification of a core set of genes that signifies pathways underlying cardiac hypertrophy［J］.Comp Funct Genomics，2004，5(6-7):459 －70.

［9］ Fu Y H，Lin Q X，Li X H，et al.A novel rat model of chronic heart failure following myocardial infarction［J］.Methods Find Exp Clin Pharmacol，2009，31(6):367 －73.

［10］ Zhao Y X，Yin H Q，Yu Q T，et al.ACE2 overexpression ameliorates left ventricular remodeling and dysfunction in a rat model of myocardial infarction［J］.Hum Gene Ther，2010，21(11):1545 －54.