王亞麗，陳龍舟，李青國(guó)

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院淮安市婦幼保健院乳腺科，江蘇淮安223002)

表觀遺傳學(xué)異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用普遍受到人們重視。基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化導(dǎo)致的基因表達(dá)的失活是表觀遺傳學(xué)改變的重要方式之一。大量的研究表明，肺癌中存在多種與其發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的抑癌基因或促凋亡基因啟動(dòng)子甲基化，其中E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化是肺癌發(fā)病的重要機(jī)制之一［1］。E-cadherin基因表達(dá)缺失或降低以及功能缺陷與肺癌的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移以及生存與預(yù)后都存在密切相關(guān)，并且大多成負(fù)相關(guān)［2］。使E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島去甲基化有望成為繼手術(shù)、放化療后治療肺癌的新方法。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，尿多酸肽(cell differentiation agentⅡ，CDA-Ⅱ)具有誘導(dǎo)包括白血病在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞凋亡和分化的作用［3］。在此試圖研究A549細(xì)胞E-cadherin甲基化狀態(tài)、CDA-Ⅱ?qū)?A549細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用及E-cadherin甲基化狀態(tài)的影響，探討CDA-Ⅱ成為新的去甲基化藥物的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 CDA-Ⅱ購(gòu)于合肥永生制藥公司，系從人尿中提取經(jīng)純化制得的，含多種有機(jī)酸和相對(duì)分子質(zhì)量＜6×103的多肽(每100 mL含馬尿酸300 mg，苯乙酰谷氨酰胺300 mg，多肽150 mg，4-羥基苯乙酸 50 mg，5-羥基吲哚乙酸 10 mg;以馬尿酸含量計(jì)，其濃度為3 g/L);細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于北京天根公司;人體E-cadherin基因甲基化檢測(cè)試劑盒購(gòu)于GENMED公司。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌A549細(xì)胞株購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清、0.1 U/L 青霉素、0.1 μg/L 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2，100%飽和濕度的溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔3天更換一次培養(yǎng)液，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)測(cè)定細(xì)胞增殖 將A549細(xì)胞按每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的CDA-Ⅱ，對(duì)照組加入等體積的 DMEM，置于37℃5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。終止培養(yǎng)前4 h每孔加 20 μL MTT(0.005 mg/L)，培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清，每孔加 150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，震蕩10 min，至結(jié)晶物充分溶解為止。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度(A490)值，以培養(yǎng)液孔為空白對(duì)照調(diào)零。計(jì)算CDA-Ⅱ每一劑量的細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(CDA-Ⅱ平均A值/細(xì)胞對(duì)照平均A值)×100%。

1.4 甲基化PCR(MSP) 收集不同處理組細(xì)胞，參照細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取基因組DNA，在UV3000紫外分光光度儀上測(cè)定吸光度值鑒定 DNA 純度，A260/A280比值均在1.8～2.0 之間。取2 μg基因組DNA參照人體E-cadherin基因甲基化檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行甲基化修飾。分別取修飾DNA及未修飾DNA100 ng進(jìn)行MSP反應(yīng)。E-cad基因甲基化引物(M):F:5'-TTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT-3';R:5'-TAACTAAAAATTCACCTACCGAC-3'。非甲基化引物(U):F:5'-TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT-3';R:5'-CACAACCAATCAACAACACA-3'。反應(yīng)體系的建立(25 μL):雙蒸水(d dH2O)7.0 μL，預(yù)混 15.0 μL，上、下引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL(100 ng)。PCR反應(yīng)時(shí)間和溫度:95℃變性9 min，95℃變性30 s，甲基化引物在57℃退火30 s，非甲基化引物在53℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)擴(kuò)增 35次，72℃5 min。使用 Gene Amp PCR System 2400擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司)。取10 μL PCR產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳，以 TIANGEN MD101為標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker同步電泳，紫外燈下觀察，凝膠成像系統(tǒng)記錄并分析。M陽(yáng)性，U陰性為完全甲基化;M陽(yáng)性，U陽(yáng)性為部分甲基化;M陰性，U陽(yáng)性為非甲基化。以各條帶的灰度值作為此樣本E-cadherin DNA表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。SPSS對(duì)MTT數(shù)據(jù)進(jìn)行概率單位模型分析，回歸方程經(jīng)過幾次疊代運(yùn)算后確定，如方程擬合優(yōu)度檢驗(yàn)χ2值、P值(＞0.05)，說(shuō)明曲線擬合良好，并顯示各效應(yīng)概率水平的劑量值(包括0.50，即IC50)。配對(duì)資料之間的比較采用配對(duì)樣本 t檢驗(yàn)，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDA-Ⅱ?qū)549細(xì)胞的生長(zhǎng)影響 CDA-Ⅱ可顯著抑制A549細(xì)胞株的生長(zhǎng)，并呈劑量依賴性增高(χ2=0.098，P ＞0.05)，2.0 g/L 的 CDA-Ⅱ作用 24 h后細(xì)胞存活率僅為3.9%(表1)。半數(shù)抑制濃度IC50為 0.23 g/L。

2.2 A549細(xì)胞 E-cadherin基因甲基化狀態(tài) 在A549細(xì)胞中E-cadherin基因甲基化狀態(tài)為部分甲基化(圖1)。

2.3 CDA-Ⅱ?qū)549細(xì)胞 E-cadherin基因甲基化程度的影響 經(jīng) 0、0.125、0.25、0.5 g/L CDA-Ⅱ作用24 h后，A549細(xì)胞E-cadherin基因甲基化程度明顯降低，呈劑量依賴性(F=37.681，P ＜0.05)(圖 2，表 2)。經(jīng) 0.25 g/L CDA-Ⅱ作用 0、24、48、72 h后，A549細(xì)胞E-cadherin基因甲基化程度明顯降低，呈時(shí)間依賴性(F=26.745，P ＜0.05)(圖 3，表3)。

表2 不同濃度CDA-Ⅱ作用24 h A549細(xì)胞E-cadherin-M表達(dá)灰度值

表3 0.25 g/L CDA-Ⅱ作用不同時(shí)間A549細(xì)胞E-cadherin-M表達(dá)灰度值

3 討論

肺癌是常見的致死性腫瘤之一，肺癌病死率之所以這樣高，很大程度上是由于臨床診斷的肺癌多為進(jìn)展期肺癌，而目前對(duì)中晚期肺癌的療效都不理想。有研究表明，由于基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化而去表達(dá)的基因，經(jīng)去甲基化藥物(如5-脫氧氮雜胞苷)處理后可以重新表達(dá)。Momparler等［4］對(duì)7例未經(jīng)任何化療藥物治療的Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者用5-脫氧氮雜胞苷周期性治療后，6例患者的生存時(shí)間隨著化療周期的延長(zhǎng)而延長(zhǎng)，其中1例患者經(jīng)過5個(gè)周期的化療后生存了6年。但5-脫氧氮雜胞苷價(jià)格昂貴，且在臨床使用中會(huì)出現(xiàn)一些不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、腹瀉、骨髓抑制、基因突變等，可能是這種藥物的特異性較差或劑量較大而對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用所致。這些缺點(diǎn)限制了它在臨床上的廣泛應(yīng)用。

CDA-Ⅱ是新研發(fā)的抗腫瘤藥物，它是健康人尿經(jīng)酸化、吸附、洗脫、真空干燥等工藝流程制成的含有多種有機(jī)酸和多肽成分的非細(xì)胞毒性尿萃取物。體外實(shí)驗(yàn)中，CDA-Ⅱ通過激活過氧化物酶體增生物激活受體γ通路誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤SWO-38細(xì)胞分化［5］。在肝細(xì)胞癌模型中，CDA-Ⅱ可改變蛋白組學(xué)外觀，誘導(dǎo)細(xì)胞分化抑制腫瘤生長(zhǎng)［6］。目前普遍認(rèn)為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是CDA-Ⅱ抗腫瘤作用機(jī)制。新的研究發(fā)現(xiàn)，CDA-Ⅱ通過下調(diào)MUTZ-1細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)DNMT1、DNMT3A 和 DNMT3B表達(dá)，發(fā)揮去甲基化作用，使PTEN啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平降低，進(jìn)而誘導(dǎo)MUTZ-1細(xì)胞凋亡［7］。Ⅱ期臨床結(jié)果顯示，CDA-Ⅱ能顯著改善晚期癌癥患者的生活質(zhì)量［8］。

本研究表明，A549細(xì)胞中存在E-cadherin基因部分甲基化，經(jīng)CDA-Ⅱ作用后，E-cadherin基因甲基化程度顯著降低，且呈劑量依賴性及時(shí)間依賴性。推測(cè)CDA-Ⅱ作為一種甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，通過抑制甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，抑制或逆轉(zhuǎn)E-cadherin基因的甲基化狀態(tài)，使E-cadherin基因重新表達(dá)，恢復(fù)其細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的功能，進(jìn)而抑制細(xì)胞的過度增殖，達(dá)到治療肺癌的目的。在國(guó)內(nèi)CDA-Ⅱ以其良好的臨床效果及相對(duì)低廉的價(jià)格，有望替代5-脫氧氮雜胞苷，成為治療存在E-cadherin基因甲基化肺癌的靶向藥物。

［1］王紅兵，苗慧，張敬川.肺癌E-cadherin基因啟動(dòng)子CpG島甲基化與蛋白表達(dá)的關(guān)系及其意義［J］.中國(guó)癌癥雜志，2007，17(8):603-606.

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