趙玉華 ，崔曉娟 ，樊 萍 ，王衛(wèi)鋒 ，李 芳 ，石敏娟

1.陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003

參芪二仙片為中華人民共和國衛(wèi)生部 《中藥成方制劑》第20冊中所收載，是由紅參、黃芪、當(dāng)歸等八味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，具有補腎填精、調(diào)補沖任、益氣養(yǎng)血的功效，用于腎虛腰膝酸軟、陽痿早泄、遺精、婦女更年期經(jīng)血不調(diào)等癥。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅有一項顯微鑒別，為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，參照有關(guān)文獻[1-5]，筆者對方中的主要藥味，進行了專屬性較強的薄層鑒別研究，并對方中的主要藥物淫羊藿中的淫羊藿苷進行了含量測定的方法學(xué)研究，結(jié)果此方法具有分離效果好、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀 （美國SSI）、超聲波清洗機 （KH-300DE）、BP211D型分析天平 （德國賽多利斯）、TGL-16G離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；人參皂苷Rg1對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110703-200726，供含量測定用）、人參皂苷Rb1對照品 （中國藥品生物制品檢定所，批號：110704-200420，供含量測定用）、當(dāng)歸對照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號：120927-200613，供鑒別用）、鹽酸小檗堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100713-200609，供含量測定用）、淫羊藿苷對照品 （中國藥品生物制品檢定所，批號：110737-200415，供含量測定用）。參芪二仙片自制（批號：080501、080502、080503）； 乙腈為色譜純， 水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 TLC法鑒別紅參 取本品25片，除去包衣，研細，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流提取3 h，三氯甲烷液備用；藥渣繼續(xù)用甲醇回流提取至近無色，提取液回收甲醇并濃縮至干，殘渣加水20 ml使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次20 ml，棄去，再用水洗2次，每次20 ml，棄去，正丁醇液水浴蒸干，殘渣加水5 ml使溶解，然后上處理好的D101大孔吸附樹脂柱（直徑 1.5 cm，高12 cm），先用水150 ml洗脫，棄去，再用50%乙醇50 ml洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。另取人參皂苷Rg1和Rb1對照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。參照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取上述兩種溶液各5 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置過夜后的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱約10 min使斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。

2.1.2 TLC法鑒別當(dāng)歸 取“2.1.1”項下的三氯甲烷提取液，水浴蒸至約5 ml作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對照藥材1 g，加乙醚20 ml回流提取30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 ml使溶解作為對照藥材溶液。參照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述兩種溶液各5 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。

2.1.3 TLC法鑒別黃柏 取本品3片，除去包衣，研細，加甲醇20 ml回流提取15 min，濾過，濾液濃縮至5 ml，作為供試品溶液。另取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液作為對照品溶液；再取黃柏對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取對照品溶液及對照藥材溶液各2 μl，供試品溶液5 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-濃氨（6.0∶3.0∶1.5∶1.5∶0.5）為展開劑，用氨蒸氣飽和后展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜及對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且陰性對照無干擾。

2.2 淫羊藿苷含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Phenomenex ODS柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（28∶72）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：270 nm；進樣量：5 μl。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計算應(yīng)不低于2000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇制成每毫升含0.010 mg的淫羊藿苷對照品溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品20片，精密稱定，除去包衣，研細，取約0.5 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，加稀乙醇約45 ml，超聲處理30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對照品溶液的制備 取缺淫羊藿的陰性對照樣品，同供試品溶液的制備方法，制備成陰性對照溶液。

2.2.5 干擾試驗 照“2.2.1”項下色譜條件，吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各5 μl，分別依次進樣。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，有色譜峰出現(xiàn)，而陰性對照液在淫羊藿苷色譜峰位置處無相應(yīng)峰出現(xiàn)，表明陰性無干擾。見圖1。

2.2.6 線性關(guān)系考察 取對照品溶液 （0.011 mg/ml）2、4、6、8、10、12 μl進樣，記錄色譜圖，測定峰面積，以峰面積（Y）對進樣量（X）進行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 Y=2677350X-436，相關(guān)系數(shù)r=0.9999（n=6）。結(jié)果表明，淫羊藿苷進樣量在0.022～0.110 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗 取對照品溶液，按擬定的色譜條件測定，重復(fù)進樣6次，結(jié)果峰面積的RSD為1.89%（n=6）。表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批號的供試液，分別每隔2 h進樣一次，于8 h內(nèi)依法進樣，結(jié)果峰面積的RSD為1.96%（n=5）。表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗 按擬定的含量測定方法，對同一樣品分別制備6份供試品溶液，測淫羊藿苷的含量，結(jié)果含量的RSD為1.51%（n=6）。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

圖1 淫羊藿苷對照品及樣品色譜圖

2.2.10 加樣回收試驗 取已知含量的樣品 （淫羊藿苷含量：0.453 mg/片）6份，每份 0.25 g，精密稱定，分別加入濃度為0.11 mg/ml的淫羊藿苷對照品溶液 3 ml，按“2.2.3”項下操作，依法制備，進樣，測定峰面積，按公式1計算回收率。結(jié)果見表 1。

公式 1：回收率（%）=[測得量（mg）-制劑中含量（mg）]/加入對照品量（mg）×100%

表1 回收率試驗結(jié)果

2.2.11 含量測定 取參芪二仙片三批樣品，按“2.2.3”項下操作制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件依法測定。結(jié)果見表2。

3 討論

本制劑中，對紅參中的人參皂苷Re也進行了鑒別研究，結(jié)果斑點顯色模糊，因此未納入標(biāo)準(zhǔn)正文；含量測定中對樣品的提取方法進行了對比研究，結(jié)果顯示回流提取與超聲提取無本質(zhì)區(qū)別，因此選擇較為簡單的超聲提取進行處理；提取溶劑選擇了甲醇、50%甲醇、乙醇和稀乙醇進行比較，結(jié)果稀乙醇提取效果較好。從樣品的含量測定數(shù)據(jù)可知，平均含量為0.447 mg/片，從大生產(chǎn)及藥材來源的角度考慮，暫定本品含淫羊藿苷不得低于0.350 mg/片。最終的含量測定限度，應(yīng)繼續(xù)積累數(shù)據(jù)，再行確定。

表2 參芪二仙片中淫羊藿苷的含量測定結(jié)果

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