肖桂青，田 云，盧向陽

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

自由基是生物體在生命活動過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，適量的自由基對細(xì)胞的分化、生長、消炎解毒起著積極的作用；但過量則會在分子水平、細(xì)胞水平乃至器官水平造成機體損傷，例如引起蛋白質(zhì)變性、酶失活、多糖降解、DNA斷裂、生物膜結(jié)構(gòu)損傷、細(xì)胞解體乃至機體病變和死亡?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，人體衰老、腫瘤發(fā)生、輻射致癌、心腦血管疾病等過程均與自由基有關(guān)[1]。

荷葉(NelumbonucifereaGaertn.)，睡蓮科植物，主產(chǎn)于湖南、湖北、浙江、江蘇等地。荷葉營養(yǎng)豐富，成分復(fù)雜，除含有植物所共有的碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、無機鹽和水分外，還含有多種生物堿類、黃酮類、精油、鞣質(zhì)、維生素C、酒石酸、枸櫞酸、蘋果酸、草酸等，其中生物堿和黃酮類化合物是荷葉主要的生物活性和生理功能成分[2]。

有報道采用電子自旋共振法或化學(xué)發(fā)光法研究荷葉水提液或醇提液對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除效果，結(jié)果表明荷葉提取液對自由基有較強的清除能力[3～5]。但對荷葉中某類化學(xué)成分清除自由基能力的研究相對較少。

作者在此應(yīng)用微弱化學(xué)發(fā)光法測定荷葉總生物堿對氧自由基的清除作用，并與荷葉水提液、荷葉醇提液及維生素C進(jìn)行比較，為進(jìn)一步明確其化學(xué)成分與生理活性提供科學(xué)依據(jù)，同時為多途徑開發(fā)利用荷葉資源提供新思路。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

荷葉采自長沙東湖；荷葉總生物堿，經(jīng)微波輔助熱回流法提取、D-101型大孔吸附樹脂純化、冷凍干燥得到。

鄰苯三酚、1，10-菲啰啉、維生素C(VC)、Na2CO3、NaHCO3、30%H2O2、CuSO4、硼酸、硼砂等均為分析純，魯米諾為色譜純。

85-1型恒溫磁力攪拌器，金壇市富華電器有限公司；AR3130型電子精密天平，奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；微量可調(diào)移液器，芬蘭雷勃公司；BPCL-2-G型微弱發(fā)光測量儀，中國科學(xué)院生物物理研究所。

1.2 方法

1.2.1 荷葉總生物堿溶液的制備

取荷葉總生物堿固體適量，用50%乙醇溶解，配制成不同濃度的溶液。

1.2.2 荷葉水提液的制備

稱取10 g荷葉粉，用100 ℃熱水提取4 h，過濾，離心，真空濃縮至50 mL。

1.2.3 荷葉醇提液的制備

稱取10 g荷葉粉，用70%乙醇回流提取4 h，過濾，離心，真空濃縮至50 mL。

在樣品池內(nèi)依次加入一定濃度梯度的樣品溶液(荷葉總生物堿、荷葉水提液、荷葉醇提液、VC)50 μL(以相應(yīng)溶劑作對照)，然后加入1 mmol·L-1鄰苯三酚10 μL、魯米諾-碳酸鹽緩沖溶液(pH值10.2)940 μL，充分混勻后，立即啟動化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，記錄60 s內(nèi)化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線。

1.2.5 清除·OH能力的測定[6]

在樣品池內(nèi)依次加入一定濃度梯度的樣品溶液(荷葉總生物堿、荷葉水提液、荷葉醇提液、VC)50 μL(以相應(yīng)溶劑作對照)，然后加入1 mmol·L-1CuSO4溶液50 μL、1 mmol·L-11，10-菲啰啉50 μL、硼酸-硼砂緩沖溶液(pH值9.0)700 μL，充分混勻后，立即啟動化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，記錄60 s內(nèi)化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線。

1.2.6 清除H2O2能力的測定[6]

在樣品池內(nèi)依次加入一定濃度梯度的樣品溶液(荷葉總生物堿、荷葉水提液、荷葉醇提液、VC)50 μL(以相應(yīng)溶劑作對照)，然后加入15%H2O2溶液50 μL、魯米諾-碳酸鹽緩沖溶液(pH值9.5)900 μL，充分混勻后，立即啟動化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，記錄60 s內(nèi)化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線。

1.3 清除氧自由基能力評價[6]

微弱化學(xué)發(fā)光法測定氧自由基清除作用時，一定范圍內(nèi)發(fā)光強度(CL)與氧自由基數(shù)量呈量效關(guān)系，因此可以用CL表示氧自由基的相對產(chǎn)生量。清除氧自由基的物質(zhì)可以降低CL，根據(jù)CL的下降則可以評價物質(zhì)清除氧自由基的能力。

一般用發(fā)光抑制率為50%時的濃度IC50來衡量樣品對氧自由基的清除能力。IC50越小，表明樣品清除氧自由基的能力越強；反之，IC50越大，表明樣品清除氧自由基的能力越弱。

2 結(jié)果與討論

2.1 荷葉總生物堿清除·能力

圖1 荷葉總生物堿清除超氧陰離子的發(fā)光曲線

表1 不同濃度荷葉總生物堿清除超氧陰離子能力

2.2 荷葉總生物堿清除·OH能力

圖2為不同濃度荷葉總生物堿清除·OH的發(fā)光動力學(xué)曲線。

圖2 荷葉總生物堿清除羥基自由基發(fā)光曲線

從圖2可以看出，不同濃度的荷葉總生物堿均可以使發(fā)光動力學(xué)曲線發(fā)生明顯的變化，表現(xiàn)為發(fā)光峰值和發(fā)光曲線面積的降低，且降低程度與荷葉總生物堿濃度相關(guān)。荷葉水提液、荷葉醇提液、VC清除·OH的發(fā)光動力學(xué)曲線與此類似。

不同濃度荷葉總生物堿清除·OH能力見表2。

表2 不同濃度荷葉總生物堿清除羥基自由基能力

2.3 荷葉總生物堿清除H2O2能力

圖3為不同濃度荷葉總生物堿清除H2O2的發(fā)光動力學(xué)曲線。

圖3 荷葉總生物堿清除過氧化氫的發(fā)光曲線

從圖3可以看出，不同濃度的荷葉總生物堿均可以使發(fā)光動力學(xué)曲線發(fā)生明顯的變化，表現(xiàn)為發(fā)光峰值和發(fā)光曲線面積的降低，且降低程度與荷葉總生物堿濃度相關(guān)。VC清除H2O2的發(fā)光動力學(xué)曲線與此類似，無法測得荷葉水提液、荷葉醇提液清除H2O2的發(fā)光動力學(xué)曲線。

不同濃度荷葉總生物堿清除H2O2能力見表3。

表3 不同濃度荷葉總生物堿清除過氧化氫能力

2.4 清除氧自由基能力對比

幾種供試物質(zhì)清除氧自由基的能力見表4。

表4 荷葉提取物和VC清除氧自由基的能力

2.5 討論

荷葉是一種藥食兼用的中藥，對疾病具有較好的療效。目前，有關(guān)荷葉提取液抗氧化性的報道較多，但有關(guān)其中抗氧自由基的有效成分的篩選報道較少。本研究通過考察荷葉總生物堿、荷葉水提液、荷葉醇提液對3種主要氧自由基的專一清除能力，證實其有效活性成分生物堿能通過抑制或清除氧自由基特別是·OH，來防止氧化損傷。荷葉提取液中因含有生物堿類成分，對·OH的清除能力較強。在眾多的自由基中，·OH最活潑、對機體危害也最大[7，8]，因此，本研究為進(jìn)一步分析荷葉提取液中的各種成分、篩選出抗氧自由基的有效成分及研究各成分間協(xié)同綜合效應(yīng)等提供了實驗基礎(chǔ)和依據(jù)。

3 結(jié)論

[1]趙晶，白云.自由基相關(guān)疾病研究進(jìn)展[J].生物學(xué)教學(xué)，2003，28(4)：6-8.

[2]孔文琦，李嚴(yán)巍.荷葉活性成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].中藥研究與信息，2005，7(6)：22-24.

[3]余以剛，陳海光，曾慶孝.荷葉水提物清除自由基的ESR研究[J].中草藥，2001，32(8)：693-695.

[4]陳海光，曾慶孝.荷葉功能成分的提取及其對自由基清除作用的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，27(10)：34-38.

[5]肖華山，黃代青，傅文慶，等.荷葉對體外氧自由基的清除作用及其對果蠅壽命的影響[J].中國老年學(xué)雜志，1996，22(6)：373-375.

[6]田云.幾種植物抗氧化劑制備、評價與應(yīng)用初步研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[7]Gutteridge J M C.Free radicals in medicine[J].BMJ，1994，309(6955)：678.

[8]Tabatabaie T，Vasquez-Weldon A，Moore D R,et al. Free radicals and the pathogenesis of type 1 diabetes：β-Cell cytokine-mediated free radical generation via cyclooxygenase-2[J].Diabetes，2003，52(8)：1994-1999.