韓增華，高 娃，張丕奇，劉佳寧，戴肖東

（黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010）

同工酶是催化功能相同而酶蛋白的分子構(gòu)型不同的酶類，同工酶結(jié)構(gòu)的相似性反映了生物間的親緣關(guān)系，因此同工酶譜資料可作為鑒定物種，研究分類、進(jìn)化、遺傳與變異的重要指標(biāo)。近十年來(lái)在真菌的分類鑒定研究中的應(yīng)用日益增多，其中用于食、藥用真菌的品種分類鑒定的同工酶主要以酯酶同工酶為主［1-3］。在黑木耳的菌株鑒別，親緣關(guān)系分析、多樣性等研究中也以酯酶同工酶研究比較多［4-6］。目前，未見(jiàn)有關(guān)東北主栽黑木耳菌株酯酶同工酶酶譜系統(tǒng)分析的報(bào)道。本文選用生產(chǎn)菌種為材料，研究東北地區(qū)常用栽培菌株的酯酶同工酶酶譜多樣性，通過(guò)分析，旨在為菌種的良種選育、種性鑒定及菌種管理等工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株共25個(gè)，詳見(jiàn)表1

表1 供試黑木耳菌株Table 1 Strains of Auricularia auricular tested in the study

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基、親和性實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基（cPDA）：土豆200g煮1000 m L汁，瓊脂粉14.0g，葡萄糖20.0g，磷酸二氫鉀3.0g，硫酸鎂1.5g，蛋白胨0.5g，維生素B110.0m g，pH自然。菌絲形態(tài)觀察用培養(yǎng)基（PDA）：土豆200g煮1000 m L汁，瓊脂粉14.0g，葡萄糖20.0 g。同工酶制備液體培養(yǎng)基：元蔥200g煮1000 m L汁，蔗糖10g，阿魏酸0.06g，pH值自然。

1.2.2 菌絲形態(tài)分類

將被試菌株分別接種于直徑為88m m盛有PDA平皿中，接種邊長(zhǎng)為2 m m正方形菌塊，25℃下恒溫培養(yǎng)，并于接種后的第十天觀察菌絲形態(tài)。

1.2.3 親和性實(shí)驗(yàn)

被試菌株兩兩配對(duì)，分別接種于直徑為88m m盛有cPDA平皿中，接種邊長(zhǎng)為2m m正方形菌塊，每?jī)蓚€(gè)品種接種間距為25 m m，25℃下恒溫培養(yǎng)，15d后觀察不同菌株菌絲相交區(qū)域的生長(zhǎng)情況。

1.2.4 同工酶測(cè)定

按張丕奇等2008方法進(jìn)行［6］。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

1.3.1 相對(duì)遷移率（R f）

電泳結(jié)束后先在指示劑移動(dòng)的位置（前沿）作標(biāo)記，染色后，量出指示劑移動(dòng)的距離和酶帶移動(dòng)的距離。Rf=X2/X1。X1：固定染色前凝膠中指示劑的遷移距離；X2：固定染色后凝膠中酶蛋白區(qū)帶的遷移距，測(cè)量Rf時(shí)，以酶帶的中部位置為準(zhǔn)。

1.3.2 相似系數(shù)

將凝膠上出現(xiàn)的條帶分類。按照條帶有無(wú)分別賦值，有帶記為1，無(wú)帶記為0。按Nei或Li（1997）公式計(jì)算菌株間的相似系數(shù)Se，其公式為：Se=2Mxy/(Mx+My+2Mxy)，式中,Mx為x菌株所獨(dú)有的譜帶數(shù)，My為y菌株所獨(dú)有的譜帶數(shù)，Mxy為x和y菌株所共有的譜帶數(shù)。

1.3.3 聚類分析

NTSYS－PC軟件進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建黑木耳菌株相似系數(shù)樹(shù)狀圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳不同菌株菌絲形態(tài)

25個(gè)被試菌株按菌落形態(tài)分成6類，菌絲生長(zhǎng)濃密、粗壯，絨毛氈狀，氣生菌絲旺，菌絲在平皿中生長(zhǎng)分布均勻的為黑29、東A1、東A3、H W 9號(hào)菌株；菌絲生長(zhǎng)稀疏、細(xì)弱，絨毛氈狀，氣生菌絲較弱，菌絲在平皿中生長(zhǎng)分布不均勻，接種點(diǎn)周圍菌絲加密為 9808、東 A2、9809A、東 A4、東 A5、916、988、H W 5、958 號(hào)菌株；菌絲生長(zhǎng)稀疏、細(xì)弱，絨毛氈狀，氣生菌絲弱，菌絲在平皿中生長(zhǎng)分布均勻?yàn)?808、東A7、豐收2號(hào)菌株；菌絲生長(zhǎng)較密、粗壯，成束，氣生菌絲旺，菌絲在平皿中生長(zhǎng)分布均勻?yàn)?81、伊耳1號(hào)菌株；菌絲生長(zhǎng)濃密、粗壯，成束，氣生菌絲旺，菌絲在平皿中生長(zhǎng)分布不均勻?yàn)殚L(zhǎng)白7號(hào)、延明 1 號(hào)、931、888、898 號(hào)菌株；菌絲較密、較弱，成束，氣生菌絲較弱，菌絲在平皿中生長(zhǎng)分布均勻?yàn)闁|A6號(hào)、長(zhǎng)城1號(hào)菌株。其中菌絲呈絨毛氈狀的菌株占實(shí)驗(yàn)菌株的64%，絨毛氈狀菌株氣生菌絲一般較弱，顏色灰白，有色素產(chǎn)生。菌絲成束的菌株氣生菌絲一般都較旺，菌絲潔白，產(chǎn)色素較絨毛氈狀弱。

2.2 黑木耳不同菌株親和性試驗(yàn)

親和試驗(yàn)可觀察出菌株間種、群親緣關(guān)系。對(duì)于親緣關(guān)系遠(yuǎn)、完全獨(dú)立的異緣或基因型不同的菌株來(lái)說(shuō)，它們間存在著不親和性反應(yīng)。而對(duì)親緣關(guān)系近或基因型相同的菌株來(lái)說(shuō)，它們之間表現(xiàn)為一定的親和性。實(shí)驗(yàn)的9809、東A3號(hào)、9809A、長(zhǎng)城1號(hào)、931和H W 5號(hào)菌株與其他被試菌株間不親和現(xiàn)象顯著，說(shuō)明它們親緣關(guān)系遠(yuǎn)，為各自獨(dú)立的菌株。888、898、958號(hào)間親和，東 A4、東 A5、東A6、東A7、916號(hào)間親和，981和H W 9號(hào)間親和，說(shuō)明每?jī)蓚€(gè)菌株之間親緣關(guān)系近。其它各菌株間均存在不同程度的不親和性，被認(rèn)為是各自獨(dú)立的菌株，同時(shí)有些菌株間親和性較高，說(shuō)明其同源性很高。

2.3 黑木耳不同菌株的酯酶同工酶酶譜

25個(gè)菌株酯酶同工酶酶譜見(jiàn)圖1，25個(gè)菌株共檢測(cè)257條酯酶同工酶譜帶，各菌株之間的遷移率分析可知，遷移率不同的譜帶有 17條，所有的譜帶均在 Rf 0.163～0.686之間，其中在Rf為0.163、0.539、0.637三處，25個(gè)菌株都有譜帶出現(xiàn)。供試的25個(gè)菌株得到了8個(gè)酶譜類型，其中黑木耳9809和東A3各為一個(gè)帶型；931為一個(gè)帶型；H W 5號(hào)為一個(gè)帶型；東 A4、東 A5、東 A6、東 A7、916、延明 1號(hào)、988、豐收2號(hào)、981、H W 9號(hào)菌株的帶型基本相同；8808、伊耳 1 號(hào)、888、898、958 號(hào)菌株帶型基本相同；黑 29、長(zhǎng)白 7號(hào)、東 A1、東 A2號(hào)菌株的帶型基本相同；9809A、長(zhǎng)城1號(hào)菌株的帶型基本相似。

圖1 供試25個(gè)菌株的酯酶同工酶酶譜Fig.1 Esterase isozyme zymogram of the 25 strains tested

2.4 酯酶同工酶的相似系數(shù)

25個(gè)菌株兩兩間遺傳相似系數(shù)（Se）的分布范圍在0.400～1.000之間，其中 9809、東 A3號(hào)、931、H W 5號(hào)各菌株與其它被試菌株的相似系數(shù)較小，說(shuō)明它們?cè)诒辉嚲曛杏H緣關(guān)系較遠(yuǎn)為各自獨(dú)立的菌株。東 A4、東 A5、東 A6、東 A7、916、延明 1 號(hào)、988、豐收2號(hào)、981、H W 9號(hào)等菌株間相似系數(shù)大，為 0.960 或 1.000；8808、伊耳 1 號(hào)、888、898、958 號(hào)菌株間相似系數(shù)為1.000，說(shuō)明菌株遺傳背景相似或?yàn)橥痪辍?/p>

2.5 聚類分析

圖2 25個(gè)菌株的酯酶同工酶聚類分析樹(shù)狀圖Fig.2 Dendrogram based on esterase isozyme cluster analysis of the 25 strains tested

根據(jù)同工酶電泳結(jié)果，在凝膠的某個(gè)相同的遷移率位置上有條帶的記為1，無(wú)條帶的記為0。用NTSYS軟件進(jìn)行聚類分析，得到了黑木耳菌株酯酶同工酶聚類分析圖（圖2），供試黑木耳菌株的酯酶同工酶遺傳相似性在0.53～1.00之間。從聚類分析樹(shù)狀圖可以直觀看出，當(dāng)遺傳相似水平為70%時(shí)，測(cè)試的25個(gè)東北地區(qū)黑木耳菌株被聚類成三大類群。當(dāng)遺傳相似水平為80%時(shí)，測(cè)試的25個(gè)黑木耳菌株可分為六大類群。第一類群：黑29、東A1、東A2、東 A3、東 A4、東 A5、東 A6、東 A7、916、延明 1號(hào)、988、豐收2號(hào)、981、H W 9號(hào)菌株；第二類群：8808、伊耳 1 號(hào)、888、898、958 號(hào)；第三類群包括931、H W 5號(hào)；第四類群有：9809A、長(zhǎng)城 1 號(hào)；第五類群有長(zhǎng)白7號(hào)；第六類群有9809號(hào)。

3 討 論

同工酶作為基因編碼的產(chǎn)物，表達(dá)的信息是DNA分子水平上的信息，作為分子遺傳標(biāo)記技術(shù)之一，它彌補(bǔ)了以菌落形態(tài)、顏色、孢子形態(tài)和子實(shí)體形態(tài)等特征傳統(tǒng)真菌分類的不足，已成為屬內(nèi)種間以及品種之間的分類鑒定的有效手段。同工酶分析已被廣泛應(yīng)用于各種食用菌的鑒別和遺傳多樣性研究［7-9］。

從供試菌株的酶譜帶型和聚類分析可以看出，部分菌株之間的帶型相似或者相同，相似系數(shù)也很高，甚至達(dá)到1.0，初步可以確認(rèn)這些菌株之間親緣關(guān)系很近，特別都是來(lái)自同一地區(qū)的菌株，如東A5、東 A6、東 A7、916、延明 1 號(hào)、988 相似系數(shù)達(dá)1.000；東 A4、豐收 2 號(hào)、981、H W 9 號(hào)菌株間相似系數(shù)為 1.000；8808、伊耳 1 號(hào)、888、898、958 號(hào)菌株間相似系數(shù)為1.000。這可能與各地互相穿插引種、菌種管理混亂等有關(guān)。近年來(lái)，隨著黑木耳栽培產(chǎn)業(yè)不斷擴(kuò)大和研究工作的深入加強(qiáng)，越來(lái)越多的新菌株、新品種通過(guò)不同選育手段獲得，積累了越來(lái)越多的在遺傳學(xué)上的新品種。但是這些新菌株也完全有可能與過(guò)去用的菌株是同一個(gè)品種，也就是同種異名，有些菌株在多年的栽培選育過(guò)程中雖有所變化，但變化不大，菌株間的相似系數(shù)就較大。這其實(shí)可能也是本試驗(yàn)中聚類結(jié)果相似度高的主要原因之一。

菌絲形態(tài)、親和性分析及酯酶同工酶技術(shù)用于菌種鑒定研究表明，菌絲形態(tài)與同工酶譜間相關(guān)性不大，形態(tài)相同的菌株在酶帶表現(xiàn)上可能相差很遠(yuǎn)。親和性的結(jié)果與同工酶間表現(xiàn)出一定相關(guān)性，不親和菌株同工酶譜帶差異較明顯。酯酶同工酶分析技術(shù)作為鑒別種和品種以下菌株的有效分析手段在混淆菌株的區(qū)分方面顯示了它的實(shí)用性和有效性。本試驗(yàn)分析的25個(gè)菌株在Rf為0.163、0.539、0.637三處都有譜帶出現(xiàn)，這可能是黑木耳的共有酯酶酶帶。25個(gè)黑木耳菌株酯酶多態(tài)性比較高，帶型類型比較豐富，菌株之間也普遍存在差異，在嚴(yán)格統(tǒng)一的條件下，其穩(wěn)定性和重復(fù)性也比較好，并且在一定程度上也可以反應(yīng)出某些菌株之間可能存在同物異名等現(xiàn)象。同時(shí)由于其操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，且不需要復(fù)雜的設(shè)備，所以在黑木耳品種鑒定、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)等方面有比較高的應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)采用洋蔥汁為同工酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基未人為添加其他蛋白，這為保證酶樣的純度提供優(yōu)良的誘導(dǎo)體系，可使菌株被誘導(dǎo)產(chǎn)生豐富的多態(tài)性條帶，利于菌株的準(zhǔn)確區(qū)分鑒定。

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