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        Red重組系統(tǒng)在克雷伯氏肺炎桿菌中的應(yīng)用研究

        2011-07-26 06:31:36莫雋穎周佳佳高黎榮付水林
        化學(xué)與生物工程 2011年8期
        關(guān)鍵詞:條帶抗性克隆

        莫雋穎,陶 冶,周佳佳,高黎榮,付水林,宮 衡

        (華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237)

        目前,克雷伯氏肺炎桿菌基因敲除的相關(guān)研究多為利用oriR6K型自殺質(zhì)粒的傳統(tǒng)敲除方法[1~4],其實(shí)驗(yàn)周期較長,且整合到受體菌株基因組上的抗性標(biāo)記無法去除,不適用于多基因突變的研究。

        Datsenko等[5]構(gòu)建了一套適用于E.coliK-12菌株靶基因快速敲除的Red重組質(zhì)粒系統(tǒng)。該系統(tǒng)需要3類質(zhì)粒,分別是:表達(dá)Exo、Beta、Gam蛋白的協(xié)助同源重組質(zhì)粒pKD46、pKD20等;兩側(cè)含F(xiàn)RT位點(diǎn)的抗性基因的質(zhì)粒pKD3、pKD4、pKD13;受誘導(dǎo)表達(dá)FLP重組酶以消除基因組上同源重組抗性基因的質(zhì)粒pCP20。利用Red重組質(zhì)粒系統(tǒng)敲除靶基因的主要流程是:(1)以pKD3/pKD4為模板,設(shè)計含40~60 bp靶基因的同源序列引物,PCR擴(kuò)增含F(xiàn)RT位點(diǎn)的抗性基因(打靶片段);(2)將打靶片段轉(zhuǎn)化到已表達(dá)Red重組酶的宿主中,抗性篩選陽性克??;(3)將pCP20導(dǎo)入篩選出的重組子中,誘導(dǎo)FLP重組酶表達(dá),移除抗性標(biāo)記。Red重組質(zhì)粒系統(tǒng)已被證實(shí)也能在其它一些菌株中有效地敲除靶基因[6,7],但目前尚沒有Red重組系統(tǒng)在克雷伯氏肺炎桿菌中應(yīng)用的報道。作者在此以莢膜基因wzi作為敲除對象[8,9],研究了Red重組系統(tǒng)在克雷伯氏肺炎桿菌中的敲除效果。

        1 實(shí)驗(yàn)

        1.1 菌株與質(zhì)粒

        K.pneumoniae,自行篩選。

        E.coliDH5α、 pKD46、 pKD4、 pCP20,自行保存;載體pMD18T、質(zhì)粒pBR322,TaKaRa公司。

        1.2 限制性內(nèi)切酶與主要試劑

        XmnⅠ限制性內(nèi)切酶,F(xiàn)ermentas公司;T4連接酶、DL 10 000TMDNA Marker,TaKaRa公司;2×TaqPCR MasterMix、2×TaqPlus PCR MasterMix、DNA MarkerⅢ、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒,北京天根公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.3 細(xì)菌培養(yǎng)、電轉(zhuǎn)化及PCR方法

        參見《分子克隆》。

        1.4 引物設(shè)計

        實(shí)驗(yàn)所用引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成,見表1。

        表1 實(shí)驗(yàn)中所用的引物

        1.5 適用于克雷伯氏肺炎桿菌的Red重組系統(tǒng)的構(gòu)建

        由于K.pneumoniae菌株本身含有Amp抗性,故pKD46與pCP20質(zhì)粒不能直接用于該菌株的基因敲除實(shí)驗(yàn),需要對其改造。通過序列查找發(fā)現(xiàn)這兩個質(zhì)粒的Amp抗性基因上有一個XmnⅠ限制性酶切位點(diǎn),且整個質(zhì)粒中該位點(diǎn)只有一個[10],在該位置插入其它抗性基因可以使這兩個質(zhì)粒具有新的抗性標(biāo)記,同時去除了Amp抗性標(biāo)記。構(gòu)建方案見圖1。

        圖1 pKD46-Tc和 pCP20-Tc的構(gòu)建

        首先擴(kuò)增適合的抗性基因。以pBR322質(zhì)粒為模板,設(shè)計其四環(huán)素抗性基因的引物F-tet和R-tet,兩端加上XmnⅠ酶切位點(diǎn),PCR擴(kuò)增tet基因,膠回收tet片段,連到pMD18 T載體后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,涂LB平板(含鹽酸四環(huán)素20 μg·mL-1),37 ℃過夜培養(yǎng)12~16 h;次日挑取單克隆擴(kuò)增后抽質(zhì)粒,用XmnⅠ酶切鑒定重組質(zhì)粒tet-pMD18T。

        用T4連接酶將片段tet分別與同樣經(jīng)XmnⅠ酶切的pKD46和pCP20 連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,涂LB平板(含鹽酸四環(huán)素20 μg·mL-1),30 ℃過夜培養(yǎng)16~20 h,挑取單克隆擴(kuò)增后抽質(zhì)粒,用XmnⅠ酶切鑒定重組質(zhì)粒pKD46-Tc和pCP20-Tc。

        將pKD46-Tc轉(zhuǎn)化到K.pneumoniae菌株中,涂LB平板(含鹽酸四環(huán)素20 μg·mL-1),30 ℃培養(yǎng)過夜,得到的K.pneumoniae/pKD46-Tc菌株陽性克隆,根據(jù)pKD46質(zhì)粒上exo-bet-gam基因設(shè)計引物F-46和R-46,進(jìn)行菌落PCR鑒定。

        1.6 二步PCR法擴(kuò)增片段△wzi::FK

        由于直接合成同源臂的成本較高且長度有限,故采用二步PCR的方法來擴(kuò)增得到重組片段[6]。以pKD4質(zhì)粒為模板,設(shè)計引物F-FRT和R-FRT,擴(kuò)增兩端含F(xiàn)RT位點(diǎn)的kan抗性基因片段FK(約1500 bp)。確定同源臂為250 bp,設(shè)計wzi片段的上游250 bp序列的兩端引物Fup-wzi和Rup-wzi::FRT,反向引物的5′端加入F-FRT的序列,wzi片段下游250 bp序列的兩端引物Fdown-FRT::wzi和Rdown-wzi,正向引物的5′端加入R-FRT的序列,以wzi-pMD18T為模板擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增得到的3個片段up-wzi、down-wzi、FK按物質(zhì)的量比1∶1∶1混合作為模板,以Fup-wzi和Rdown-wzi為引物,擴(kuò)增片段△wzi::FK(1981 bp)。

        1.7 wzi基因缺失陽性重組子的獲得

        制備K.pneumoniae/pKD46-Tc電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,加20 mmol·L-1L-阿拉伯糖,30 ℃誘導(dǎo)Red重組酶表達(dá)2.5 h。電轉(zhuǎn)化體系為5 μL △wzi::FK片段+100 μLK.pneumoniae/pKD46-Tc感受態(tài)細(xì)胞,電轉(zhuǎn)化條件2500 V、5~6 ms,轉(zhuǎn)化后涂LB板(含卡那霉素20 μg·mL-1),37 ℃過夜培養(yǎng)。以wzi上下游外側(cè)的序列設(shè)計重組子鑒定引物Fupout-wzi和Rdownout-wzi,菌落PCR鑒定基因敲除的效果。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 重組質(zhì)粒tet-pMD18T的構(gòu)建

        tet基因的PCR產(chǎn)物及tet-pMD18T的XmnⅠ酶切片段見圖2。

        1.tet基因的PCR產(chǎn)物 2、3.tet-pMD18T的XmnⅠ酶切片段M.DNA MarkerⅢ

        由圖2可看出,重組質(zhì)粒tet-pMD18T的酶切片段有3個。這是因?yàn)?,pMD18T質(zhì)粒本身含有一個XmnⅠ酶切位點(diǎn),中間那條1300 bp左右的片段為tet片段。

        2.2 重組質(zhì)粒pKD46-Tc與pCP20-Tc的構(gòu)建

        重組質(zhì)粒pKD46-Tc和pCP20-Tc的酶切鑒定結(jié)果見圖3。

        1.pKD46-Tc digested by XmnⅠ 2.pCP20-Tc digested by XmnⅠ 3.pKD46-Tc plasmid 4.pCP20-Tc plasmid M1.DL 10 000TM DNA Marker M2.DNA MarkerⅢ

        在圖3中2000~1000 bp的位置能看到一條目的片段。由于重組質(zhì)粒pKD46-Tc和pCP20-Tc是低拷貝質(zhì)粒,量較少,所以酶切的片段不是太明顯。由于克隆的是Tc抗性基因,菌體能在Tc抗性的培養(yǎng)基中生長,表明該基因已成功表達(dá),故不測序。

        2.3 K.pneumoniae/pKD46-Tc菌株的篩選(圖4)

        1~11.the 11 monoclones 12.pKD46-Tc plasmid(positive) 13.K.pneumoniae(negative) M.DNA MarkerⅢ

        由圖4可以看出,1#~10#陽性克隆均有相似大小的條帶,11#克隆沒有條帶,12#陽性對照有明顯的目的片段(1922 bp),13#陰性對照無條帶。表明1#~10#均轉(zhuǎn)入了pKD46-Tc,得到了K.pneumoniae/pKD46-Tc菌株。

        2.4 二步PCR法擴(kuò)增片段△wzi::FK(圖5)

        1.up-wzi 2.down-wzi 3~12.退火溫度(℃):45、46.2、47.4、50.2、53.1、40、44、48.8、51.2、53.6 M.DNA MarkerⅢ

        由圖5a可以看出,up-wzi和down-wzi片段的大小在250 bp左右處,與理論位置相符。由圖5b可以看出,在1500 bp左右有明顯的條帶,應(yīng)為FK片段,且隨退火溫度的升高條帶亮度逐漸增強(qiáng)。估算up-wzi濃度約為60 ng·μL-1、down-wzi濃度約為20 ng·μL-1、FK濃度約為10 ng·μL-1。由圖5c可以看出,除了目的條帶△wzi::FK(1981 bp)外還有一些非特異條帶。膠回收圖中2000 bp左右的條帶,考慮到以此條帶為模板PCR擴(kuò)增的效果不好,存在較多非特異性條帶,擴(kuò)增前需要將該片段與T載體相連進(jìn)行亞克隆。

        2.5 wzi基因缺失重組子的鑒定

        卡那霉素抗性平板上長出9個克隆,用引物Fupout-wzi和Rdownout-wzi PCR鑒定,結(jié)果見圖6。

        1~9.陽性克隆 10.K.pneumoniae genome DNA(未敲除的基因?qū)φ? 11.ddH2O(陰性對照) M.DNA MarkerⅢ

        未敲除的原始序列PCR產(chǎn)物應(yīng)該在1500 bp左右的位置,理論上重組子PCR產(chǎn)物應(yīng)該在2000 bp左右的位置。由圖6可以初步確定9個克隆中有6個是wzi基因敲除的重組子,其余3個克隆為假陽性。

        3 結(jié)論

        通過構(gòu)建含四環(huán)素抗性標(biāo)記的重組質(zhì)粒pKD46-Tc和pCP20-Tc,建立了一套能在K.pneumoniae菌株中運(yùn)用的Red重組系統(tǒng),以莢膜基因中的高保守wzi基因?yàn)榍贸龑ο?,?dǎo)入同源臂為250 bp的打靶片段Δwzi::FK,轉(zhuǎn)化后得到6個重組子,通過菌落PCR鑒定初步確定敲除了K.pneumoniae菌株的wzi基因。在后續(xù)的研究中,需要利用pCP20-Tc質(zhì)粒表達(dá)FLP重組酶將抗性篩選標(biāo)記去除,得到不含抗性基因的基因敲除重組子,并且對wzi基因缺失株的莢膜表達(dá)進(jìn)行鑒定,分析wzi基因缺失對莢膜多糖合成的影響。Red重組系統(tǒng)的建立為后續(xù)K.pneumoniae菌株代謝途徑有關(guān)基因突變株的構(gòu)建奠定了一定基礎(chǔ)。

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