■文/王 偉

液相色譜是原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測重要的初篩手段，實際工作中如果檢測出來樣品中含有高于檢出限濃度的三聚氰胺，要用氣質和液質進行確認，因為液相法有很多時候檢出是假陽性。但作為基層檢測機構，液相色譜仍然是經濟、實用的方法。GB/T22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》規(guī)定高效液相色譜法檢測原料乳與乳制品中三聚氰胺為第一法。筆者就本實驗室的條件對該方法進行了驗證實驗，并總結了檢測中的操作技術要點。

方法原理

1.原理:試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經陽離子交換固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜法測定，外標法定量。

2.試劑與材料:甲醇、乙腈、氨水、三氯乙酸、檸檬酸、庚烷磺酸鈉、三聚氰胺標準品、陽離子交換固相萃取柱、定性濾紙、海砂、微孔濾膜、氮氣均按GB/T22388-2008規(guī)定。

3.儀器和設備:P200Ⅱ型高效液相色譜儀-紫外檢測器。離心機、超聲波水浴、固相萃取裝置、氮氣吹干儀、具塞塑料離心管。

4.樣品處理:樣品用三氯乙酸溶液提取、用陽離子交換固相萃取柱凈化、吹氮氣保護濃縮、定容。

5.高效液相色譜測定:色譜參考條件:島津C8柱250n m，用離子對試劑:乙腈(95:5)的流動相條件，島津C18柱250n m，用離子對試劑:乙腈(90:10)的流動相條件。波長:240nm。柱溫:40℃。

技術要點

1.樣品提取

1)樣品溶解:實驗中，固體樣品如奶粉加三氯乙酸溶液直接超聲，超聲后奶粉有時并不能溶解。效果比較好的做法是稱取奶粉樣品2.0g置于50mL的離心管中，試劑分次加，先加10毫升的三氯乙酸溶液，震蕩幾下，使之溶解，后用5毫升三氯乙酸溶液和5毫升乙腈沖干凈離心管壁，然后搖晃幾下，混勻后待超聲。

2)超聲、振蕩、離心:為了提取的徹底，我們參考N Y/T1372-2007標準，超聲時間20分鐘，然后振蕩，這個步驟很重要，通過比較，僅超聲不振蕩提取效果差一些。水浴搖床對50毫升的離心管來說效果不太好，直接加蓋后用手動振搖，注意時間要保證10分鐘，效果比較好；或者把試樣稱取在25ml的容量瓶中提取，在水浴搖床上振搖10分鐘，同時給予40℃的保溫加熱，提取效果也很好。

實驗證明離心轉速越大離心的效果越好，我們使用9000～10000轉的轉速，離心5分鐘。不同品種的樣品，有些樣品會存在離心后有脂肪組織漂在上面的現(xiàn)象。如果沒有脂肪，可以把上清液不過濾直接定容至25毫升；如果有脂肪可采用先過濾后定容的方式比較好。

2.凈化過柱。一是每一批小柱都要先測試一次小柱的加標回收率，以確定小柱的性能是否達到使用要求。二是小柱在使用之前必須要活化，否則吸附不了要分析的物質。三是整個凈化過程中不能讓小柱干了，注意液體在接近干的時候就要加入下一種液體，小柱干了，柱床會產生裂縫，直接影響到加標回收率。四是凈化過程要控制過柱的流速，因為流速過快導致該吸附的物質沒有吸附完全而影響到加標回收率。最后當洗脫液濾干的時候，可以用負壓抽一下，把小柱里沒法通過重力流下來的洗脫液抽下來，確保收集完全。

3.上機測定。洗脫液用氮氣吹干，殘留物用1ml的流動相定容，供高效液相色譜儀測定。用流動相將三聚氰胺標準品配置為標準規(guī)定的濃度系列，上機測得峰面積，以峰面積-濃度作圖，得到回歸方。同時測定待測樣品。使用的液相色譜儀和色譜柱不同，出峰時間和分離效果也不相同。通常我們使用日本島津公司的液相色譜儀，用島津C8柱用離子對試劑:乙腈(95:5)的流動相條件，島津C18柱用離子對試劑:乙腈(90:10)的流動相條件。在遇到干擾峰和三聚氰胺峰分不開、干擾峰和三聚氰胺峰重疊，或干擾峰的保留時間和標樣保留時間基本一致，可以考慮適當調整流動相配比以達到干擾峰與三聚氰胺峰分離開的效果。按照上面的處理步驟，加標回收率在85%～106%左右，符合實驗要求。