李貴文， 張明芮

(皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽蕪湖241002)

鎖陽(yáng)又名不老藥、銹鐵棒、地毛球、羊鎖不拉［1］，是鎖陽(yáng)科植物鎖陽(yáng)Cynomorium songaricum Rupr.的干燥肉質(zhì)莖，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血、潤(rùn)腸通便的作用，臨床上主要用于腰膝痿軟、陽(yáng)萎滑精、腸燥便秘等證。鎖陽(yáng)還在防癌、抗癌、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、延緩衰老、防治心血管疾病、治療白細(xì)胞減少等方面有明顯的效果［2-4］。鎖陽(yáng)含多種化學(xué)成分及藥用成分，其中，熊果酸是一種三萜類化合物，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、抗?jié)兊榷喾N生物學(xué)效應(yīng)，熊果酸還具有明顯的抗氧化功能，因而被廣泛地用作醫(yī)藥和化妝品原料［5］。

傳統(tǒng)醇提法得到的提取液中熊果酸量較低，不能很好的發(fā)揮熊果酸的藥用價(jià)值。大孔吸附樹脂具有吸附性強(qiáng)，解吸附容易，機(jī)械強(qiáng)度好，可反復(fù)使用和流體阻力小等優(yōu)點(diǎn)。近年來大孔吸附樹脂在天然藥物化學(xué)成分的提取、分離純化、制劑工藝改革、制劑質(zhì)量分析等方面有了較廣泛的應(yīng)用研究［6］。本實(shí)驗(yàn)采用多種型號(hào)的大孔吸附樹脂研究熊果酸的吸附和解析性能，篩選出最佳的樹脂，并對(duì)影響吸附和解析的一系列工藝參數(shù)進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

JASCO日本分光公司LC-2000高效液相色譜儀;PU-2086高壓色譜泵;UV-2075紫外檢測(cè)器;色譜工作站(HPLC-2000);色譜柱 HiQsil C18W(4.6 mm ×250 mm);玻璃層析柱￠10 mm×300 mm(美國(guó)Amersham Biosciences公司);X-5、D101、D1400、AB-8、DM130、DM301、DA201、NKA-9 大孔吸附樹脂(天津市海光化工有限公司);ME235S電子分析天平(德國(guó)Sartorius賽多利斯);TDL-5離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);PHS-4CT型精密酸度計(jì)(上海大普儀器有限公司)等。甘肅產(chǎn)優(yōu)質(zhì)鎖陽(yáng);熊果酸對(duì)照品(批號(hào):110742-200516，中國(guó)食品藥品檢定研究院);色譜甲醇;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鎖陽(yáng)中熊果酸測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件的確定 以保留時(shí)間定性，峰面積定量。根據(jù)文獻(xiàn)［7］確定最佳色譜條件如下:流動(dòng)相為甲醇－0.02 mol/L磷酸二氫鈉(75∶25)，體積流量1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm;經(jīng)精密度(RSD為0.37%)和加樣回收率(98.6%)實(shí)驗(yàn)，表明儀器精密度良好。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取一定量的熊果酸對(duì)照品，置于250 mL量瓶中，加入流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻即得(8.74 μg/mL)。熊果酸對(duì)照品色譜保留值11.671。

2.1.3 樣品測(cè)定 分別精密吸取熊果酸對(duì)照品溶液(經(jīng)微孔濾膜過濾)5、7.5、10、12.5、15 μL 注入高效液相色譜儀，測(cè)定熊果酸峰面積積分值。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，熊果酸進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程Y=4170000X －11573(r=0.9998，n=5)，表明熊果酸質(zhì)量在0.0437～0.1311 μg之間有良好線性關(guān)系。取供試品溶液，經(jīng)稀釋，微孔濾膜過濾后，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定熊果酸峰面積積分值(Y)，代入回歸方程計(jì)算熊果酸濃度。

2.2 樣品中熊果酸測(cè)定［7］精密稱取樣品粉末(60目)約1 g，加入20 mL無水乙醇冷浸1 h后，用無水乙醇超聲提取3次［20 mL(20 min)，15 mL(20 min)，10 mL(10 min)］，第 1次超聲時(shí)用冷浸液，不再加無水乙醇。合并提取液濾過，置50 mL量瓶中，用無水乙醇定容。精密吸取2 mL置10 mL量瓶中，將無水乙醇揮干后，用流動(dòng)相定容。經(jīng)微孔濾膜過濾后，依上述色譜條件分析。平行進(jìn)行三組實(shí)驗(yàn)，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.726%。對(duì)照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 熊果酸對(duì)照品及樣品HPLC色譜圖

2.3 上柱溶液的制備［8］稱取一定量的鎖陽(yáng)粉，用最佳提取條件提取熊果酸。提取液離心，取上清液濃縮回收乙醇后進(jìn)行醇沉，除去多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。再減壓回收乙醇至無醇味，繼續(xù)依次加入石油醚、二氯甲烷萃取，以除去鎖陽(yáng)中的色素和其他脂溶性雜質(zhì)。將粗提物溶于蒸餾水，制成靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附所需要的多種濃度。

2.4 靜態(tài)吸附解析實(shí)驗(yàn)［9］

2.4.1 吸附量的測(cè)定 精確稱取樹脂1 g，處理后加入具塞錐形瓶中。精密加入熊果酸質(zhì)量濃度2.27 mg/mL的上柱液100 mL，室溫下震蕩吸附24 h，取樣分析，按下式計(jì)算吸附量(Q)。

Q(mg/g樹脂)=(C0－Ce)×V/W

式中:C0—起始質(zhì)量濃度，Ce—平衡質(zhì)量濃度

V—吸附液體積，W—樹脂質(zhì)量

2.4.2 洗脫率的測(cè)定 將吸附了熊果酸的樹脂濾過，用水洗滌，置于具塞錐形瓶中，加入90%的乙醇100 mL，室溫下震蕩解析24 h，取樣分析，按下式計(jì)算解析率(D)。

D(%)=CDVD/［(C0－Ce)×V］×100

式中:CD—解析液質(zhì)量濃度;VD—解析液體積

2.4.3 樹脂的篩選 按照使用方法將樹脂處理好，備用［10］。8種樹脂在相同條件下對(duì)鎖陽(yáng)提取液中熊果酸的吸附量和解析率見表1。由表1可知DM130樹脂的吸附量與解析率都較高，這與樹脂的性質(zhì)和熊果酸的性質(zhì)密切相關(guān)，DM130樹脂具有弱極性且比表面積也比較大，因而適于吸附非極性和弱極性的化合物，而熊果酸本身屬于弱極性分子因而吸附量較高。雖然NKA-9的吸附量更高，但是由于極性較大，分子間作用力較強(qiáng)因而不宜解析。故選擇DM130樹脂進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

表1 樹脂的主要特征

2.5 DM130樹脂對(duì)熊果酸的吸附性能［9］

2.5.1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)過程 將一定量樹脂放入上柱液中，使其充分吸附達(dá)到飽和，測(cè)定含量(平行測(cè)定2次，取平均值)。以吸附時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo)作出熊果酸在DM130樹脂上的吸附動(dòng)力學(xué)曲線。由圖2可見，初始階段吸附速率較快，100 min后吸附量增加緩慢，160 min后已基本達(dá)最大吸附量。

圖2 吸附量隨時(shí)間的變化

2.5.2 上柱液質(zhì)量濃度對(duì)吸附性能的影響 取相同量的樹脂，分別放入不同質(zhì)量濃度的上柱液中使吸附達(dá)飽和，平行測(cè)定2次，取平均值。由圖3可見濃度過低，過高都不利于吸附的進(jìn)行，質(zhì)量濃度過低樹脂處理量大但需時(shí)較長(zhǎng)，效率低;過高不利于吸附的進(jìn)行，在初始質(zhì)量濃度1.4～1.8 mg/mL之間吸附量達(dá)飽和。

圖3 吸附量隨上柱液質(zhì)量濃度的變化

2.5.3 上柱液pH值對(duì)吸附性能的影響 稱取相同量的樹脂，分別放入不同pH值的上柱液中使吸附達(dá)到飽和，平行測(cè)定2次，取平均值。由圖4可知在pH 5.7左右吸附量最大，pH過低熊果酸以佯鹽形式存在，不利于其吸附，過高則以離子形式存在，極性增強(qiáng)，也不利于被弱極性的樹脂吸附，

故選擇pH 5.70作為最佳pH。

圖4 吸附量隨上柱液pH值的變化

2.5.4 上柱液體積流量對(duì)吸附的影響 在最佳上柱液濃度和pH條件下分別以1 BV/h(BV:樹脂床體積)，2 BV/h，3 BV/h的體積流量進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，定時(shí)取樣(平行測(cè)定2次，取平均值)測(cè)定流出液質(zhì)量濃度，以質(zhì)量濃度200 mg/L作為溢出點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)表明體積流量越慢越有利于吸附的進(jìn)行，樹脂的處理量越大，但體積流量過慢需時(shí)較長(zhǎng)，效率低。在上柱液質(zhì)量濃度1.64 mg/mL下，1 BV/h的上柱體積流量可處理的上柱液是18 BV，2 BV/h可處理16 BV，而3 BV/h只能處理11 BV，1 BV/h、2 BV/h處理的量相差不是太大，考慮到經(jīng)濟(jì)性選擇2 BV/h作為最佳上柱體積流量。見圖5。

圖5 流出液中熊果酸質(zhì)量濃度隨床體積的變化

2.6 DM130樹脂對(duì)熊果酸的解析性能

2.6.1 洗脫液質(zhì)量濃度對(duì)解析性能的影響 配制不同質(zhì)量濃度的乙醇洗脫液，先水洗已吸附達(dá)飽和的樹脂至還原糖反應(yīng)為陰性，再用15%的乙醇將雜質(zhì)洗下，然后以相同洗脫體積流量對(duì)樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫，測(cè)定洗脫液質(zhì)量濃度(平行測(cè)定2次，取平均值)，求得累積洗脫率。實(shí)驗(yàn)表明在含醇量為80% 時(shí)洗脫率已接近最大值，質(zhì)量濃度過低不利于洗脫的進(jìn)行，過高則會(huì)將色素等雜質(zhì)一并洗下，影響產(chǎn)品質(zhì)量，故選擇最佳含醇量為80%。見圖6。

圖6 解析率隨含醇量的變化

2.6.2 洗脫體積流量對(duì)解析性能的影響 分別采用0.5 BV/h，1 BV/h，2 BV/h的洗脫體積流量對(duì)已吸附達(dá)飽和的樹脂進(jìn)行洗脫，定量取樣測(cè)定流出液中熊果酸的質(zhì)量濃度(平行測(cè)定2次，取平均值)。結(jié)果表明，體積流量越慢洗脫效果越好，這主要是因?yàn)轶w積流量越慢越有利于熊果酸在樹脂和洗脫液間進(jìn)行相擴(kuò)散和膜擴(kuò)散，從而達(dá)到溶解平衡。由圖7可見在0.5 BV/h的體積流量下，洗脫峰比較集中，3.5 BV的洗脫液就可達(dá)到洗脫完全，而其他體積流量則分別為5 BV和8 BV，因而選擇0.5 BV/h作為最佳洗脫體積流量。

圖7 洗脫液中熊果酸濃度隨床體積的變化

2.7 產(chǎn)品的制備 在最佳的吸附和解析條件下對(duì)熊果酸進(jìn)行吸附和解析，解析液濃縮，真空低溫干燥后取樣測(cè)定熊果酸量。平行進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果產(chǎn)品中熊果酸的量平均為46.1%。

3 結(jié)論

3.1 吸附樹脂在分離中草藥有效成分時(shí)的應(yīng)用是利用吸附的可逆性(即解吸)。由于樹脂極性、孔徑、比表面積不同，對(duì)熊果酸吸附作用力強(qiáng)弱不同，解吸難易也有別。由實(shí)驗(yàn)從八種大孔吸附樹脂中選擇出了吸附和解析效果較好的弱極性樹脂DM130。

3.2 得到了熊果酸吸附和解析的最佳工藝條件，即:質(zhì)量濃度在1.4 ～1.8 mg/mL 范圍內(nèi)，pH 5.70，吸附流速 2 BV/h下，可處理樣品溶液16 BV。在洗脫劑含醇量80%，洗脫體積流量0.5 BV/h下，3.5 BV就可將熊果酸充分洗脫下，過柱得率達(dá)到91.3%。產(chǎn)品濃縮，低溫真空干燥，經(jīng)液相色譜檢測(cè)純度達(dá)到46.1%，而原料中僅為0.726%，由此可見采用大孔樹脂吸附法顯著富集、純化產(chǎn)品，效果良好。

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