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        甜菜硝酸還原酶基因編碼氨基酸偏好及功能預(yù)測分析

        2011-07-26 13:52:54丁廣洲馬鳳鳴
        中國糖料 2011年4期
        關(guān)鍵詞:還原酶甜菜硝酸

        丁廣洲 ,侯 靜 ,馬鳳鳴

        (1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所,哈爾濱150080;2.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院,哈爾濱150080;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,哈爾濱150030)

        在高等植物氮代謝過程中,與NO3-還原有關(guān)的基因包括NR基因(nia)和NiR基因(nii)。高等植物的NR由nia編碼。至今,nia或nia cDNA至少已在下列植物中被克?。翰げ耍≒rosser&Lazarus,1990;Tamura等,1997;Kubo 等,1998)、筍瓜(Crawford 等,1986;Hyde 等,1991)、煙草(Cherel等,1990;Vaucheret等,1989;Yamamoto 等,2006)、 擬南芥 (Cheng 等,1988;Crawford 等,1988;Wilkinson&Crawford,1991,1993)、 水稻(Choi等,1989;Matsumoto 等,2005;Ohyanagi等,2006;Itoh 等,2007)、 大豆 (Wu 等,1995)、 玉米(Campbell等,1995;Katagi等,1999)、番茄(Daniel-Vedele 等,1989;王利群,2003)、桃(Nakamura 等,2001)、菜豆(Hoff等,1991;Jensen 等,1994,1996)、 大麥 (Miyazaki等,1991,Schnorr等,1991)、 馬鈴薯 (Harris 等,1997;Yamamoto 等,2003)、甘藍型油菜(Fukuoka,1996)、蓖麻(Tsai等,2003)、矮牽牛(Salamoubat&Budang,1993)等。目前,還沒有其他的關(guān)于甜菜硝酸還原酶基因全序列被克隆注冊的報道。

        1 材料與方法

        1.1 供試品種

        實驗采用黑龍江省甜菜(Beta vulgaris L.)主栽二倍體純系品種甜研7號(Ty7),原種由中國農(nóng)科院甜菜研究所提供。種子在室溫下浸種7h,置于培養(yǎng)皿中25℃恒溫培養(yǎng)24~48h萌發(fā),定植至營養(yǎng)缽中,置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待植株長到2~4對真葉時進行硝酸鉀(30mmol/L KNO3)誘導(dǎo)處理,然后用于實驗操作。

        1.2 采用RACE技術(shù)克隆甜菜硝酸還原酶基因

        取硝酸鉀誘導(dǎo)后的甜菜葉片0.1 g,使用Trizol試劑盒(Invitrogen,USA)提取總RNA,電泳檢測其質(zhì)量,置-70℃保存。前期利用同源序列克隆技術(shù)篩選拼接得到一個1438bp NR基因片段。采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech,USA)進行5′端和3′端的RACE反應(yīng)。根據(jù)中間片段設(shè)計基因特異性引物(GSP)(表 1)。 以 5′GSP 與 UPM 引物擴增基因的 5′端,反應(yīng)程序為:5 個循環(huán)(94℃ 30 s,72℃ 3 min);5個循環(huán)(94℃ 30 s,70℃ 30 s,72℃ 3 min);20 個循環(huán)(94℃ 30 s,58.7℃ 30 s,72℃ 3 min),4℃保存。 以 3′GSP與UPM引物擴增基因的3′端,反應(yīng)程序為:5個循環(huán)(94℃ 30 s,72℃ 3 min);5 個循環(huán)(94℃ 30 s,70℃ 30 s,72℃ 3 min);25 個循環(huán) (94℃ 30 s,62℃30 s,72℃3 min),4℃保存。將PCR產(chǎn)物電泳條帶切下,按照 TIAN gel Midi Purification Kit使用說明書回收PCR產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物連接到pEASY-T1載體上,轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到Trans1-T1感受態(tài)細胞中。挑取白色單克隆培養(yǎng),使用通用引物正反向引物(表1)鑒定陽性克隆。

        表1 試驗中采用的引物及序列

        1.3 生物信息學(xué)分析

        將選取的陽性克隆測序,根據(jù)測序結(jié)果拼接出基因的全長序列。應(yīng)用NCBI的ORF finder軟件對全長cDNA序列進行可讀框架分析;利用BLAST P程序在NCBI網(wǎng)站通過同源性比對驗證基因的完整性,并進行保守結(jié)構(gòu)域分析;蛋白質(zhì)等電點和分子量計算 http://www.expasy.ch/cgi-bin/pi;利用DNASTAR中的EditSeq計算cDNA序列的GC含量;利用ClustalX 1.83和BOXSHADE 3.21在線軟件(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)進行氨基酸序列相似性比對分析。

        2 結(jié)果與討論

        采用RACE技術(shù)對前期研究獲得的1438bp的中間片段進行全長序列克隆,3′RACE克隆獲得了1109bp的序列;5′RACE克隆獲得了803bp的序列,回收產(chǎn)物利用通用引物鑒定,顯示克隆結(jié)果較好。使用 Contig Express軟件將5′RACE序列、中間序列和3′RACE序列拼接,獲得全長序列3247bp,找到了完整的ORF。甜菜Ty7 nia cDNA全序列共3247bp,含有一個2718bp的開放閱讀框(ORF);包括147bp的5′非翻譯區(qū)(UTR)和382 bp的3′非翻譯區(qū)。該序列編碼905個氨基酸,分子量大小為102kD(ExPaSy的分子量分析),等電點為6.12。將全序列提交NCBI的GenBank注冊,注冊序列號為:EU163265。

        2.1 基因的密碼子偏好和編碼產(chǎn)物氨基酸組成

        在cDNA編碼蛋白的氨基酸序列中,Gly含量最多為7.85%,其次為Glu 7.62%,第三為Val 7.29%,Cys含量最少為1.55%(見表2)。因此,甜菜硝酸還原酶基因編碼氨基酸具有甘氨酸偏好。編碼蛋白的氨基酸序列中含有14個Cys,說明編碼產(chǎn)物中可能含有二硫鍵?,F(xiàn)有的研究表明,植物NR蛋白C'端都具有二肽 (Cys-Gly)保守的基序。

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        2.2 基因編碼產(chǎn)物的功能預(yù)測

        參照Daniel的方法,推測甜菜硝酸還原酶基因編碼的氨基酸殘基及其功能。表3是對該基因編碼的氨基酸殘基及其功能的分析。

        從甜菜硝酸還原酶基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域分析,從第93個氨基酸開始進入3個氧化還原中心的功能區(qū)(MoCo、Fe-血紅素、FAD),其中 93~478為鉬輔因子功能區(qū)(eukary NR Moco),含有386個氨基酸殘基;535~608 為 Fe-血紅素結(jié)合區(qū)(Cyt-b5),含 75個氨基酸;653~760為 FAD結(jié)合區(qū)(FAD binding 6)。 從 779~888 為 NADH 綁縛區(qū)(NADH binding 1)。 詳見圖 1。

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        2.3 可能的酶水解位點和磷酸化位點

        在連接3個氧化還原中心的兩個絞鏈區(qū)中,絞鏈區(qū)I有3個可能被胰蛋白酶(trypsin)水解(hydrolysis)的精氨酸位點(-475、-510、-522);兩個可能被金黃葡萄球菌 V8 蛋白水解酶 (S.aureus V8 pro-tease)水解的谷氨酸位點(-487、-513);另外含有4個容易被磷酸化的-Ser位點,(-502、-515、-525、-533)。絞鏈區(qū)Ⅱ也有 3 個可能被胰蛋白酶(trypsin)水解(hydrolysis)的精氨酸位點(-642、-649、-651);一個可能被金黃葡萄球菌 V8 蛋白水解酶(S.aureus V8 pro-tease)水解的谷氨酸位點(-606)(見圖 2)。

        3 結(jié)論

        克隆獲得甜菜硝酸還原酶基因,該基因編碼905個氨基酸,具有甘氨酸偏好,含有高等植物硝酸還原酶所特有的功能結(jié)構(gòu)域:3個氧化還原中心的功能區(qū)(MoCo、Fe-血紅素、FAD)。在連接3個氧化還原中心的兩個絞鏈區(qū)中,分別具有若干可被胰蛋白酶水解的酶切位點和磷酸化位點。

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