丁廣洲 ，侯 靜 ，馬鳳鳴

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080；2.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030）

在高等植物氮代謝過程中，與NO3-還原有關(guān)的基因包括NR基因（nia）和NiR基因（nii）。高等植物的NR由nia編碼。至今，nia或nia cDNA至少已在下列植物中被克隆：菠菜（Prosser&Lazarus，1990；Tamura等，1997；Kubo 等，1998）、筍瓜（Crawford 等，1986；Hyde 等，1991）、煙草（Cherel等，1990；Vaucheret等，1989；Yamamoto 等，2006）、 擬南芥 （Cheng 等，1988；Crawford 等，1988；Wilkinson&Crawford，1991,1993）、 水稻（Choi等，1989；Matsumoto 等，2005；Ohyanagi等，2006；Itoh 等，2007）、 大豆 （Wu 等，1995）、 玉米（Campbell等，1995；Katagi等，1999）、番茄（Daniel-Vedele 等，1989；王利群，2003）、桃（Nakamura 等，2001）、菜豆（Hoff等，1991；Jensen 等，1994，1996）、 大麥 （Miyazaki等，1991，Schnorr等，1991）、 馬鈴薯 （Harris 等，1997；Yamamoto 等，2003）、甘藍(lán)型油菜（Fukuoka，1996）、蓖麻（Tsai等，2003）、矮牽牛（Salamoubat&Budang，1993）等。目前，還沒有其他的關(guān)于甜菜硝酸還原酶基因全序列被克隆注冊的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 供試品種

實(shí)驗(yàn)采用黑龍江省甜菜（Beta vulgaris L.）主栽二倍體純系品種甜研7號(hào)（Ty7），原種由中國農(nóng)科院甜菜研究所提供。種子在室溫下浸種7h，置于培養(yǎng)皿中25℃恒溫培養(yǎng)24～48h萌發(fā)，定植至營養(yǎng)缽中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待植株長到2～4對真葉時(shí)進(jìn)行硝酸鉀（30mmol/L KNO3）誘導(dǎo)處理，然后用于實(shí)驗(yàn)操作。

1.2 采用RACE技術(shù)克隆甜菜硝酸還原酶基因

取硝酸鉀誘導(dǎo)后的甜菜葉片0.1 g，使用Trizol試劑盒（Invitrogen，USA）提取總RNA，電泳檢測其質(zhì)量，置-70℃保存。前期利用同源序列克隆技術(shù)篩選拼接得到一個(gè)1438bp NR基因片段。采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，USA）進(jìn)行5′端和3′端的RACE反應(yīng)。根據(jù)中間片段設(shè)計(jì)基因特異性引物（GSP）（表 1）。 以 5′GSP 與 UPM 引物擴(kuò)增基因的 5′端，反應(yīng)程序?yàn)椋? 個(gè)循環(huán)（94℃ 30 s，72℃ 3 min）；5個(gè)循環(huán)（94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min）；20 個(gè)循環(huán)（94℃ 30 s，58.7℃ 30 s，72℃ 3 min），4℃保存。 以 3′GSP與UPM引物擴(kuò)增基因的3′端，反應(yīng)程序?yàn)椋?個(gè)循環(huán)（94℃ 30 s，72℃ 3 min）；5 個(gè)循環(huán)（94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min）；25 個(gè)循環(huán) （94℃ 30 s，62℃30 s，72℃3 min），4℃保存。將PCR產(chǎn)物電泳條帶切下，按照 TIAN gel Midi Purification Kit使用說明書回收PCR產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物連接到pEASY-T1載體上，轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。挑取白色單克隆培養(yǎng)，使用通用引物正反向引物（表1）鑒定陽性克隆。

表1 試驗(yàn)中采用的引物及序列

1.3 生物信息學(xué)分析

將選取的陽性克隆測序，根據(jù)測序結(jié)果拼接出基因的全長序列。應(yīng)用NCBI的ORF finder軟件對全長cDNA序列進(jìn)行可讀框架分析；利用BLAST P程序在NCBI網(wǎng)站通過同源性比對驗(yàn)證基因的完整性，并進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析；蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量計(jì)算 http：//www.expasy.ch/cgi-bin/pi；利用DNASTAR中的EditSeq計(jì)算cDNA序列的GC含量；利用ClustalX 1.83和BOXSHADE 3.21在線軟件（http：//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）進(jìn)行氨基酸序列相似性比對分析。

2 結(jié)果與討論

采用RACE技術(shù)對前期研究獲得的1438bp的中間片段進(jìn)行全長序列克隆，3′RACE克隆獲得了1109bp的序列；5′RACE克隆獲得了803bp的序列，回收產(chǎn)物利用通用引物鑒定，顯示克隆結(jié)果較好。使用 Contig Express軟件將5′RACE序列、中間序列和3′RACE序列拼接，獲得全長序列3247bp，找到了完整的ORF。甜菜Ty7 nia cDNA全序列共3247bp，含有一個(gè)2718bp的開放閱讀框（ORF）；包括147bp的5′非翻譯區(qū)（UTR）和382 bp的3′非翻譯區(qū)。該序列編碼905個(gè)氨基酸，分子量大小為102kD（ExPaSy的分子量分析），等電點(diǎn)為6.12。將全序列提交NCBI的GenBank注冊，注冊序列號(hào)為：EU163265。

2.1 基因的密碼子偏好和編碼產(chǎn)物氨基酸組成

在cDNA編碼蛋白的氨基酸序列中，Gly含量最多為7.85%，其次為Glu 7.62%，第三為Val 7.29%，Cys含量最少為1.55%（見表2）。因此，甜菜硝酸還原酶基因編碼氨基酸具有甘氨酸偏好。編碼蛋白的氨基酸序列中含有14個(gè)Cys，說明編碼產(chǎn)物中可能含有二硫鍵?，F(xiàn)有的研究表明，植物NR蛋白C'端都具有二肽 （Cys-Gly）保守的基序。

?

2.2 基因編碼產(chǎn)物的功能預(yù)測

參照Daniel的方法，推測甜菜硝酸還原酶基因編碼的氨基酸殘基及其功能。表3是對該基因編碼的氨基酸殘基及其功能的分析。

從甜菜硝酸還原酶基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域分析，從第93個(gè)氨基酸開始進(jìn)入3個(gè)氧化還原中心的功能區(qū)（MoCo、Fe-血紅素、FAD），其中 93～478為鉬輔因子功能區(qū)（eukary NR Moco），含有386個(gè)氨基酸殘基；535～608 為 Fe-血紅素結(jié)合區(qū)（Cyt-b5），含 75個(gè)氨基酸；653～760為 FAD結(jié)合區(qū)（FAD binding 6）。 從 779～888 為 NADH 綁縛區(qū)（NADH binding 1）。 詳見圖 1。

?

2.3 可能的酶水解位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)

在連接3個(gè)氧化還原中心的兩個(gè)絞鏈區(qū)中，絞鏈區(qū)I有3個(gè)可能被胰蛋白酶（trypsin）水解（hydrolysis）的精氨酸位點(diǎn)（-475、-510、-522）；兩個(gè)可能被金黃葡萄球菌 V8 蛋白水解酶 （S.aureus V8 pro-tease）水解的谷氨酸位點(diǎn)（-487、-513）；另外含有4個(gè)容易被磷酸化的-Ser位點(diǎn)，（-502、-515、-525、-533）。絞鏈區(qū)Ⅱ也有 3 個(gè)可能被胰蛋白酶（trypsin）水解（hydrolysis）的精氨酸位點(diǎn)（-642、-649、-651）；一個(gè)可能被金黃葡萄球菌 V8 蛋白水解酶（S.aureus V8 pro-tease）水解的谷氨酸位點(diǎn)（-606）（見圖 2）。

3 結(jié)論

克隆獲得甜菜硝酸還原酶基因，該基因編碼905個(gè)氨基酸，具有甘氨酸偏好，含有高等植物硝酸還原酶所特有的功能結(jié)構(gòu)域：3個(gè)氧化還原中心的功能區(qū)（MoCo、Fe-血紅素、FAD）。在連接3個(gè)氧化還原中心的兩個(gè)絞鏈區(qū)中，分別具有若干可被胰蛋白酶水解的酶切位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)。

[1]Crawford N M，H N Arst.The molecular genetics of nitrate assimilation in fungi and plants[J].Annu.Rev.Genet.， 1993，27：115-146.

[2]Crawford N M，Campbell W H，Davis R.Nitrate reductase from squash：cDNA cloning and nitrate regulation[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83（21）：8073-8076.

[3]Melzer J M，A Kleinhofs and R L Warner.Nitrate reductase regulation：effects of nitrate and light on nitrate reductase mRNA accumulation[J].Molecular and General Genetics，1989，217（2－3）：341-346.

[4]Crawford N M.Nitrate：nutrient and signal for plant growth[J].Plant Cell，1995，7：859-868.

[5]Dawn E.Tucker，Damian J.Allen，Donald R.Ort.Control of nitrate reductase by circadian and diurnal rhythms in tomato[J].Planta，2004，219（2）：277-285.

[6]Vaucheret H，Vincenta M，Kronenberger J，et al.Molecular cloning and characterization of the two homeologous genes coding for nitrate reductase in tobacco[J].Mol.Gen.Genet.，1989，216（1）：10-15.

[7]Jensen P E，Hoff T，Moiler M G，et al.Identification and characterization of a nitrate reduetase gene from bean （Phaseolus vulgaris） contgxning four introns[J].Physiol.Plant.，1994，92：613-623.

[8]Hoff T，Stummann B M，Henningssen K W.Cloning and expression of gene encoding a root specific nitrate reductase in bean（Phaseolus vulgaris）[J].Physiol.Plant.，1991，82（2）：197-204.

[9]Prosser I M and Lazarus C M.Nucleotide sequence of a spinach nitrate reductase cDNA[J].Plant Mol.Biol.， 1990，15（1）：187-190.

[10]Tamura N，Takahashi H，Takeba G，et al.The nitrate reductase gene isolated from DNA of cultured spinach[J].Biochim.Biophys.Acta.，1997，1338（2）：151-155.

[11]Hyde G E，W H Campbell.Highlevel expression in Escherichia coli of the catalytically active flavin domain of com leaf NADH：nitrate reductase and its comparison to human NADH：cytochrome b5 reductase[J].Biochem.Biophys.Res.Commun.，1990，168（3）：1285-1291.

[12]Cherel I，Gonneau M，Meyer C，et al.Biochemical and immunological characterization of nitrate reduetese-defieient nia mutants of Nicotiana plumbaginifolia[J].Plant Physiol.，1990，92（3）：659-665.

[13]Yamamoto-Katou A，Katou S，Yoshioka H，et al.Nitrate reductase is responsible for elicitin-induced nitric oxide production in Nicotiana benthamiana[J].Plant Cell Physiol.，2006，47（6）：726-735.

[14]Cheng C L，G N Acedo，J Dewdney，et al.Differential expression of the two Arabidopsis nitrate reductase genes[J].Plant Physiol.，1991，96（1）：275-279.

[15]Wilkinson J Q and Crawford N M.Identification and characterization of a chlorate-resistant mutant of Arabidopsis thaliana with mutations in both nitrate reductase[J].Mol.Gen.Genet.，1993，239 （1-2）：289-297.

[16]Choi H，Kieinhofs A，An G.Nucleotide sequence of rice nitrate reductase genes[J].Plant Mol.Biol.，1989，13（6）：731-733.

[17]Wu S，Lu Q，Kriz A L and Harper J E.Identification of cDNA clones corresponding to two inducible nitrate reductase genes in soybean：analysis in wild-type and nr1 mutant[J].Plant Mol.Biol.，1995，29 （3）：491-506.

[18]Daniel-Vedele F，Dorbe M F，Caboche M，et al.Cloning and analysis of the tomato nitrate reductase-encoding gene:protein domain structure and amino acid homologies in higher plants[J].Gene.，1989，85（2）：371-380.

[19]Jensen P E，Hoff T，Stummann B M，et al.Functional analysis of two bean nitrate reductase promoters in transgenic tobacco[J].Physiol.Plant.，1996，96（3）：357-358.

[20]Miyazaki J，Juricek M，Angelis K，et al.Characterrization and sequence of a novel nitrate reductase from barley[J].Mol.Gen.Genet.，1991，228（3）：329-334.

[21]Schnorr K M，Juricek M，Huang C，et al.Analysis of barley nitrate reductase cDNA and genomic coones[J].Mol.Gen.Genet.，1991，227（3）：411-416.

[22]Fukuoka H，Ogawa T，Minami H，et al.Developmental stage-specific and nitrate independent regulation of nitrate reductase gene expression in rapeseed[J].Plant Physiol.，1996，111（1）：39-47.

[23]Tsai CB，Kaiser WM，Kaldenhoff R.Molecular cloning and characterization of nitrate reductase from Ricinus communis L.heterologously expressed in Pichia pastoris[J].Planta.，2003，217（6）：962-700.

[24]Fei-Fei Sun，Xi-Lin Hou，Ying Li，Xue-Dong Yang.Molecular cloning and characterization of nitrate reductase gene from nonheading Chinese cabbage[J].Scientia Horticulturae.，2008，119（1）：1-10.

[25]Thomas Hettmann，Roman A.Siddiqui，Christa Frey et al.Mutagenesis study on amino acids around the molybdenum centre of the periplasmic nitrate reductase from Ralstonia eutropha[J].Biochemical and Biophysical Research Communications.，2004，320（4）：1211-1219.

[26]王利群，王勇，董英，等.硝酸鹽對硝酸還原酶活性的誘導(dǎo)及硝酸還原酶基因的克隆[J].生物工程學(xué)報(bào)，2003，19（5）：632-635.

[27]Mesnard F，Ratcliffe R G.NMR analysis of plant nitrogen metabolism[J].Photosynthesis Research.，2005，83（2）：163-180.

[28]Jie Li，Lexun Xue，Hongxia Yan，et al.The nitrate reductase gene-switch：A system for regulated expression in transformed cells of Dunaliella salina[J].Gene.，2007，403（15）：132-142.