丁廣洲 ，侯 靜 ，馬鳳鳴

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080；2.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030）

在高等植物氮代謝過程中，與NO3-還原有關(guān)的基因包括NR基因（nia）和NiR基因（nii）。高等植物的NR由nia編碼。至今，nia或nia cDNA至少已在下列植物中被克?。翰げ耍≒rosser&Lazarus，1990；Tamura等，1997；Kubo 等，1998）、筍瓜（Crawford 等，1986；Hyde 等，1991）、煙草（Cherel等，1990；Vaucheret等，1989；Yamamoto 等，2006）、 擬南芥 （Cheng 等，1988；Crawford 等，1988；Wilkinson&Crawford，1991,1993）、 水稻（Choi等，1989；Matsumoto 等，2005；Ohyanagi等，2006；Itoh 等，2007）、 大豆 （Wu 等，1995）、 玉米（Campbell等，1995；Katagi等，1999）、番茄（Daniel-Vedele 等，1989；王利群，2003）、桃（Nakamura 等，2001）、菜豆（Hoff等，1991；Jensen 等，1994，1996）、 大麥 （Miyazaki等，1991，Schnorr等，1991）、 馬鈴薯 （Harris 等，1997；Yamamoto 等，2003）、甘藍型油菜（Fukuoka，1996）、蓖麻（Tsai等，2003）、矮牽牛（Salamoubat&Budang，1993）等。目前，還沒有其他的關(guān)于甜菜硝酸還原酶基因全序列被克隆注冊的報道。

1 材料與方法

1.1 供試品種

實驗采用黑龍江省甜菜（Beta vulgaris L.）主栽二倍體純系品種甜研7號（Ty7），原種由中國農(nóng)科院甜菜研究所提供。種子在室溫下浸種7h，置于培養(yǎng)皿中25℃恒溫培養(yǎng)24～48h萌發(fā)，定植至營養(yǎng)缽中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待植株長到2～4對真葉時進行硝酸鉀（30mmol/L KNO3）誘導(dǎo)處理，然后用于實驗操作。

1.2 采用RACE技術(shù)克隆甜菜硝酸還原酶基因

取硝酸鉀誘導(dǎo)后的甜菜葉片0.1 g，使用Trizol試劑盒（Invitrogen，USA）提取總RNA，電泳檢測其質(zhì)量，置-70℃保存。前期利用同源序列克隆技術(shù)篩選拼接得到一個1438bp NR基因片段。采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，USA）進行5′端和3′端的RACE反應(yīng)。根據(jù)中間片段設(shè)計基因特異性引物（GSP）（表 1）。 以 5′GSP 與 UPM 引物擴增基因的 5′端，反應(yīng)程序為：5 個循環(huán)（94℃ 30 s，72℃ 3 min）；5個循環(huán)（94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min）；20 個循環(huán)（94℃ 30 s，58.7℃ 30 s，72℃ 3 min），4℃保存。 以 3′GSP與UPM引物擴增基因的3′端，反應(yīng)程序為：5個循環(huán)（94℃ 30 s，72℃ 3 min）；5 個循環(huán)（94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min）；25 個循環(huán) （94℃ 30 s，62℃30 s，72℃3 min），4℃保存。將PCR產(chǎn)物電泳條帶切下，按照 TIAN gel Midi Purification Kit使用說明書回收PCR產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物連接到pEASY-T1載體上，轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到Trans1-T1感受態(tài)細胞中。挑取白色單克隆培養(yǎng)，使用通用引物正反向引物（表1）鑒定陽性克隆。

表1 試驗中采用的引物及序列

1.3 生物信息學(xué)分析

將選取的陽性克隆測序，根據(jù)測序結(jié)果拼接出基因的全長序列。應(yīng)用NCBI的ORF finder軟件對全長cDNA序列進行可讀框架分析；利用BLAST P程序在NCBI網(wǎng)站通過同源性比對驗證基因的完整性，并進行保守結(jié)構(gòu)域分析；蛋白質(zhì)等電點和分子量計算 http：//www.expasy.ch/cgi-bin/pi；利用DNASTAR中的EditSeq計算cDNA序列的GC含量；利用ClustalX 1.83和BOXSHADE 3.21在線軟件（http：//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）進行氨基酸序列相似性比對分析。

2 結(jié)果與討論

采用RACE技術(shù)對前期研究獲得的1438bp的中間片段進行全長序列克隆，3′RACE克隆獲得了1109bp的序列；5′RACE克隆獲得了803bp的序列，回收產(chǎn)物利用通用引物鑒定，顯示克隆結(jié)果較好。使用 Contig Express軟件將5′RACE序列、中間序列和3′RACE序列拼接，獲得全長序列3247bp，找到了完整的ORF。甜菜Ty7 nia cDNA全序列共3247bp，含有一個2718bp的開放閱讀框（ORF）；包括147bp的5′非翻譯區(qū)（UTR）和382 bp的3′非翻譯區(qū)。該序列編碼905個氨基酸，分子量大小為102kD（ExPaSy的分子量分析），等電點為6.12。將全序列提交NCBI的GenBank注冊，注冊序列號為：EU163265。

2.1 基因的密碼子偏好和編碼產(chǎn)物氨基酸組成

在cDNA編碼蛋白的氨基酸序列中，Gly含量最多為7.85%，其次為Glu 7.62%，第三為Val 7.29%，Cys含量最少為1.55%（見表2）。因此，甜菜硝酸還原酶基因編碼氨基酸具有甘氨酸偏好。編碼蛋白的氨基酸序列中含有14個Cys，說明編碼產(chǎn)物中可能含有二硫鍵?，F(xiàn)有的研究表明，植物NR蛋白C'端都具有二肽 （Cys-Gly）保守的基序。

?

2.2 基因編碼產(chǎn)物的功能預(yù)測

參照Daniel的方法，推測甜菜硝酸還原酶基因編碼的氨基酸殘基及其功能。表3是對該基因編碼的氨基酸殘基及其功能的分析。

從甜菜硝酸還原酶基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域分析，從第93個氨基酸開始進入3個氧化還原中心的功能區(qū)（MoCo、Fe-血紅素、FAD），其中 93～478為鉬輔因子功能區(qū)（eukary NR Moco），含有386個氨基酸殘基；535～608 為 Fe-血紅素結(jié)合區(qū)（Cyt-b5），含 75個氨基酸；653～760為 FAD結(jié)合區(qū)（FAD binding 6）。 從 779～888 為 NADH 綁縛區(qū)（NADH binding 1）。 詳見圖 1。

?

2.3 可能的酶水解位點和磷酸化位點

在連接3個氧化還原中心的兩個絞鏈區(qū)中，絞鏈區(qū)I有3個可能被胰蛋白酶（trypsin）水解（hydrolysis）的精氨酸位點（-475、-510、-522）；兩個可能被金黃葡萄球菌 V8 蛋白水解酶 （S.aureus V8 pro-tease）水解的谷氨酸位點（-487、-513）；另外含有4個容易被磷酸化的-Ser位點，（-502、-515、-525、-533）。絞鏈區(qū)Ⅱ也有 3 個可能被胰蛋白酶（trypsin）水解（hydrolysis）的精氨酸位點（-642、-649、-651）；一個可能被金黃葡萄球菌 V8 蛋白水解酶（S.aureus V8 pro-tease）水解的谷氨酸位點（-606）（見圖 2）。

3 結(jié)論

克隆獲得甜菜硝酸還原酶基因，該基因編碼905個氨基酸，具有甘氨酸偏好，含有高等植物硝酸還原酶所特有的功能結(jié)構(gòu)域：3個氧化還原中心的功能區(qū)（MoCo、Fe-血紅素、FAD）。在連接3個氧化還原中心的兩個絞鏈區(qū)中，分別具有若干可被胰蛋白酶水解的酶切位點和磷酸化位點。

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