高 婷，胡 倩，潘志權(quán)

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 綠色化工過(guò)程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430073)

燈盞花，又名燈盞細(xì)辛，為菊科飛蓬屬短葶飛蓬(Erigeronbreviscapus(vant.) Hand.-mass)的干燥全草。主要分布于我國(guó)的西南地區(qū)，其性寒，味微苦，甘溫辛，具有散熱解表、活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、舒經(jīng)治癱、祛風(fēng)除濕和消炎止痛等功效[1]。自1979年以來(lái)，燈盞花已被制成針劑和片劑應(yīng)用于臨床，主要用于治療缺血性心腦血管疾病[2]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)燈盞花進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，從中分離鑒定得到60多種成分[3～5]，主要成分為黃酮及黃酮苷類(lèi)、芳香酸類(lèi)、萜類(lèi)、糖苷(主要是燈盞花苷)類(lèi)。其中燈盞花素(含燈盞甲素和燈盞乙素)被認(rèn)為是燈盞花中的主要活性成分。

HPLC-ESI-MS/MS技術(shù)具有分析速度快、分辨率高、靈敏度高的特點(diǎn)，能在線(xiàn)提供每個(gè)譜峰的分子量和結(jié)構(gòu)信息，可以快速鑒定出分析樣品的成分。作者在此采用HPLC-ESI-MS/MS方法對(duì)燈盞花的石油醚部分進(jìn)行成分分析，為燈盞花的研究開(kāi)發(fā)及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑和儀器

燈盞花全草由云南省紅河千山生物工程有限公司提供。

乙醇、石油醚(60～90℃)、甲酸、乙酸、乙酸銨，分析純；甲醇、乙腈，色譜純；MilliQ水。

高效液相色譜泵(DIONEX公司)，DIONEX C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，離子阱質(zhì)譜，電噴霧接口，工作站及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)，F(xiàn)innigan公司)。

1.2 樣品制備

稱(chēng)取5.0 g燈盞花全草粉末置具塞燒瓶中，加入150 mL 70%乙醇，超聲萃取1 h；低溫減壓回收溶劑，得粗浸膏1.5 g；將粗浸膏混懸于10 mL水中，用石油醚 (3×10 mL) 萃取，低溫減壓回收溶劑，得石油醚浸膏0.32 g；用甲醇將石油醚浸膏配成濃度為1.0 mg·mL-1的溶液，取適量離心5 min(1200 r·min-1)，吸取上清液10 mL，過(guò)0.45 μm濾膜后待用。

1.3 測(cè)試條件

色譜條件：流動(dòng)相A為水(含0.1%甲酸)、B為乙腈；柱溫20℃；檢測(cè)波長(zhǎng)321 nm；流速0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL。梯度洗脫：0～5 min，A相77%，B相23%；5～10 min，B相從23%升至30%，A相相應(yīng)降至70%；10～12 min，B相從30%逐漸升至45%，A相相應(yīng)降至55%；12～15 min，B相從45%升至50%，A相相應(yīng)降至50%；15～20 min，B相從50%逐漸升至55%，A相相應(yīng)降至45%；20～40 min，A相為45%，B相為55%。

質(zhì)譜條件：鞘氣為45 unit·min-1；噴霧電壓為4.5 kV；加熱毛細(xì)管溫度為300℃。正負(fù)離子模式檢測(cè)，掃描范圍m/z為150～1000，二級(jí)質(zhì)譜打碎能量范圍為25%～30%。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液中主要成分分離

流動(dòng)相條件經(jīng)優(yōu)化選擇，確定乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，33 min內(nèi)可將各組分較好地分離。燈盞花石油醚部分樣品經(jīng)高效液相色譜分離后得到20個(gè)色譜峰，其中5個(gè)峰由于離子化不好，基線(xiàn)干擾較大，未取得質(zhì)譜數(shù)據(jù)。燈盞花石油醚提取物在相應(yīng)的總離子流圖(圖1)中分別編號(hào)為峰1～5。

圖1 燈盞花石油醚浸提物在正模式(a)和負(fù)模式(b)的總離子流圖

2.2 化合物的鑒定

根據(jù)樣品的來(lái)源，已知樣品中可能含有燈盞乙素、燈盞甲素、芹菜素等，通過(guò)分析MS/MS信息，并與已報(bào)道的文獻(xiàn)資料相對(duì)照，鑒定出其中兩種黃酮為燈盞甲素和芹菜素，此外推測(cè)出其中含有黃芩苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、山礬堿或阿西米羅賓。

峰1～5的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2～6。

圖2 峰1的MS和MS2譜圖

化合物1(tR=6.18 min)，紫外光譜在280 nm 和355 nm處有最大吸收，顯示黃酮類(lèi)化合物的特征吸收峰。由圖2可知，化合物1一級(jí)質(zhì)譜的分子離子峰為m/z463 [M+H]+，推測(cè)分子質(zhì)量M=462，其二級(jí)質(zhì)譜圖出現(xiàn)碎片離子峰m/z287 [M+1-176]+，即為失去葡萄糖醛酸后的苷元碎片離子峰。根據(jù)樣品來(lái)源及與文獻(xiàn)對(duì)比[6]，判斷化合物1為燈盞乙素。

圖3 峰2的MS和MS2譜圖

化合物2(tR=8.95 min)，紫外光譜在270 nm、330 nm處有吸收峰，為典型的黃酮類(lèi)化合物紫外的帶Ⅰ和帶Ⅱ特征峰。由圖3可知，化合物2一級(jí)質(zhì)譜的分子離子峰為m/z447 [M+H]+，推測(cè)分子質(zhì)量M=446，其二級(jí)質(zhì)譜圖出現(xiàn)碎片離子峰m/z271 [M+1-176]+，即為失去葡萄糖醛酸后的苷元碎片離子峰。化合物2與燈盞乙素分子量相差16，主要的二級(jí)碎片也相差16，推測(cè)該化合物比燈盞乙素少了一個(gè)羥基，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[6]，判斷化合物2為黃芩苷。

圖4 峰3的MS和MS2譜圖

化合物3(tR=15.55 min)，紫外光譜在290 nm處有一個(gè)吸收峰。由圖4可知，化合物3一級(jí)質(zhì)譜的分子離子峰為m/z268 [M+H]+，推測(cè)分子質(zhì)量M=267，說(shuō)明分子中含有奇數(shù)個(gè)N，化合物二級(jí)和三級(jí)質(zhì)譜的主要碎片峰為m/z251和222，根據(jù)文獻(xiàn)[7]，符合該分子量和電噴霧規(guī)律的化合物有兩個(gè)同分異構(gòu)體，分別為山礬堿和阿西米羅賓。由于缺乏其它信息，無(wú)法確認(rèn)屬于哪一種化合物。

圖5 峰4的MS和MS2譜圖

化合物4(tR=16.04 min)，紫外光譜在295 nm處有最大吸收。由圖5可知，化合物4一級(jí)質(zhì)譜的分子離子峰為m/z433 [M+H]+，推測(cè)分子質(zhì)量M=432，其二級(jí)質(zhì)譜沒(méi)有給出質(zhì)譜數(shù)據(jù)。根據(jù)樣品來(lái)源和文獻(xiàn)對(duì)比[8]，判斷化合物4為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

圖6 峰5的MS和MS2譜圖

化合物5(tR=17.12 min)，紫外光譜在265 nm和335 nm處有最大吸收，顯示黃酮化合物的特征吸收。

由圖5可知，化合物5一級(jí)質(zhì)譜的分子離子峰為m/z269 [M-H]-，推測(cè)分子質(zhì)量M=270，其二級(jí)質(zhì)譜的主要碎片峰為m/z225，根據(jù)樣品來(lái)源及文獻(xiàn)對(duì)比，與標(biāo)準(zhǔn)品芹菜素對(duì)照且紫外吸收也一致，故判斷化合物5為芹菜素。

3 結(jié)論

運(yùn)用HPLC-ESI-MS/MS技術(shù)對(duì)燈盞花石油醚提取物復(fù)雜成分進(jìn)行了快速的分離和表征。根據(jù)質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜，并結(jié)合UV譜圖及文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)燈盞花HPLC分離出的20個(gè)主要峰進(jìn)行分析，確定了5個(gè)主要成分的可能結(jié)構(gòu)，分別為燈盞乙素、黃芩苷、芹菜素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、山礬堿或阿西米羅賓。這些成分在燈盞花化學(xué)成分分析中曾有報(bào)道。從總離子流色譜圖可以看出，燈盞花石油醚部位所含的成分十分復(fù)雜，一些量大的化合物還未能鑒定，有待進(jìn)一步的研究。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：100.

[2] 劉長(zhǎng)庚，黃生高，范國(guó)才.燈盞花的研究進(jìn)展[J].中華醫(yī)學(xué)寫(xiě)作雜志，2005，12(14)：1239-1243.

[3] 張衛(wèi)東，陳萬(wàn)生，王永紅.燈盞花黃酮苷化學(xué)成分的研究[J].中草藥，2000，31(8)：565-566.

[4] 黃洪波，包文芳，楊芳芳，等.燈盞花的化學(xué)成分研究[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，18(4)：266-267，293.

[5] 王玲，肖艷華，胡倩，等.燈盞花素研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程，2007，24(9)：9-12.

[6] 梁振，段繼誠(chéng)，張維冰，等.HPLC-ESI-MS/MS對(duì)燈盞花提取液中主要成分的分離定性[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，20(2)：129-132.

[7] 叢浦珠，李筍玉.天然有機(jī)質(zhì)譜學(xué)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2003：274.

[8] 張衛(wèi)東，陳萬(wàn)生，王永紅，等.燈盞花中兩個(gè)新苷類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定[J].中國(guó)中藥雜志，2001，26(10)：689-690.