韓秋菊，張倩倩

(遼寧石油化工大學(xué)，遼寧 撫順 113001)

纖維素酶能使不溶性纖維素材料水解成簡單糖，進(jìn)而發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，廣泛用于農(nóng)業(yè)、食品、釀酒、紡織、再生能源以及環(huán)境治理等領(lǐng)域[1～4]。中度嗜鹽菌分布極其廣泛，在鹽堿環(huán)境(鹽湖、海洋等鹽水環(huán)境，鹽堿地、鹽池等鹽土環(huán)境，鹽漬發(fā)酵食品等人工環(huán)境)中能夠存在[5]。其產(chǎn)生的纖維素酶也同樣具有在鹽堿環(huán)境中發(fā)揮作用的特性。研究發(fā)現(xiàn)，中度嗜鹽菌具有很多潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。首先其易于在高鹽環(huán)境中生長繁殖，因而能夠最大程度地減少發(fā)酵過程中其它菌類的污染；同時營養(yǎng)要求比較簡單，可以利用多種有機(jī)物作為碳源和氮源；中度嗜鹽菌產(chǎn)生的酶在不同的鹽度和溫度下都能保持良好的活性，能滿足工業(yè)操作單元中特殊的物理和化學(xué)條件[6]。

作者在此利用中度嗜鹽菌HS1發(fā)酵產(chǎn)生纖維素酶，并對發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。由中度嗜鹽菌產(chǎn)生的纖維素酶在鹽堿環(huán)境中依然能保持活性，很大程度上拓寬了纖維素酶的應(yīng)用范圍，對于解決目前纖維素酶生產(chǎn)存在的穩(wěn)定性差、產(chǎn)量低、成本高等問題有著重要的指導(dǎo)意義。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株

中度嗜鹽菌HS1，遼寧石油化工大學(xué)生物工程教研室保存。

1.2 培養(yǎng)基

嗜鹽菌培養(yǎng)基：酪蛋白水解物5%，酵母粉0.5%，MgSO4·7H2O 0.2%，NCl 10%，K2HPO41%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酪蛋白水解物0.075%，酵母提取物0.1%，檸檬酸鈉0.3%，MgSO4·7H2O 2%，KCl 0.2%，F(xiàn)eSO40.005%，NaCl 10%，麩皮5%。

1.3 方法

首先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別研究氮源、液體種子接種量、培養(yǎng)溫度、初始pH值、培養(yǎng)時間等因素對菌株HS1產(chǎn)纖維素酶的影響；再基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

1.4 纖維素酶活力測定

1.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[7]

取1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入3 mL DNS試劑于25 mL比色管中混勻，置于沸水浴中5 min，冷卻至室溫，定容至25 mL，搖勻，在520 nm波長處測定吸光值。以葡萄糖濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。擬合線性回歸方程為y=1.2113x+0.0175，R2=0.9946。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.2 酶活力的定義

在30℃、pH值為6的條件下，1 h分解纖維素產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol葡萄糖所需的酶量，定義為一個酶活力單位。酶活力(U，U·mL-1)依下式計算：

式中：W為方程中計算出的相應(yīng)的葡萄糖的濃度，mg·mL-1；1000為將mg折合為μg；n為酶液稀釋總倍數(shù)；0.5為反應(yīng)時間，h；M為樣品的分子量(葡萄糖為180)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氮源對中度嗜鹽菌HS1產(chǎn)纖維素酶的影響

分別添加1%尿素、1% NaNO3、1%蛋白胨、1% NH4Cl和1% (NH4)2SO4作為菌株HS1液體發(fā)酵氮源，培養(yǎng)24 h后測定纖維素酶活力，結(jié)果見圖2。

圖2 氮源對中度嗜鹽菌HS1產(chǎn)纖維素酶的影響

由圖2可知，NaNO3作為氮源時，菌株HS1產(chǎn)纖維素酶活力最大。進(jìn)一步考察NaNO3濃度對中度嗜鹽菌HS1產(chǎn)纖維素酶的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 NaNO3濃度對中度嗜鹽菌HS1產(chǎn)纖維素酶的影響

由圖3可知，NaNO3濃度為1.5%時，纖維素酶的酶活力最大，為(52.58±1.52) U·mL-1。

2.2 液體種子接種量對中度嗜鹽菌HS1產(chǎn)纖維素酶的影響(圖4)

圖4 液體接種量對中度嗜鹽菌HS1產(chǎn)纖維素酶的影響

由圖4可知，液體種子接種量為8%時，纖維素酶的酶活力最大，為(43.54±8.13) U·mL-1。

2.3 初始pH值對中度嗜鹽菌HS1產(chǎn)纖維素酶的影響(圖5)

圖5 初始pH值對中度嗜鹽菌HS1產(chǎn)纖維素酶的影響

由圖5可知，當(dāng)初始pH值為6.5時，纖維素酶的酶活力最大，為(51.32±6.51) U·mL-1。

2.4 培養(yǎng)溫度對中度嗜鹽菌HS1產(chǎn)纖維素酶的影響(圖6)

圖6 培養(yǎng)溫度對中度嗜鹽菌HS1產(chǎn)纖維素酶的影響

由圖6可知，培養(yǎng)溫度在30～40℃范圍內(nèi)纖維素酶具有較高的活性，當(dāng)培養(yǎng)溫度為35℃時，纖維素酶的酶活力最大，為(53.20±2.88) U·mL-1。

2.5 培養(yǎng)時間對中度嗜鹽菌HS1產(chǎn)纖維素酶的影響(圖7)

圖7 培養(yǎng)時間對中度嗜鹽菌HS1產(chǎn)纖維素酶的影響

由圖7可知，培養(yǎng)前期酶活力隨著培養(yǎng)時間的延長而增加；培養(yǎng)時間為3 d左右時酶活力達(dá)到最大，為(46.28±3.01) U·mL-1。

2.6 中度嗜鹽菌HS1產(chǎn)纖維素酶的正交實(shí)驗(yàn)[8](表2)

由表2可知，最佳實(shí)驗(yàn)組合為A2B1C2D3，即優(yōu)化的發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度35℃、培養(yǎng)時間4 d、初始pH值6.5、液體種子接種量6%。

3 結(jié)論

對中度嗜鹽菌HS1產(chǎn)纖維素酶進(jìn)行了研究。單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株HS1產(chǎn)纖維素酶的最佳氮源是1.5% NaNO3，優(yōu)化的發(fā)酵條件為：液體種子接種量6%，培養(yǎng)溫度35℃、初始pH值6.5、培養(yǎng)時間4 d。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

[1] 肖春玲，徐常新.微生物纖維素酶的應(yīng)用研究[J].微生物學(xué)雜志，2002，22(2)：33-35.

[2] 馮定遠(yuǎn)，劉玉蘭.酶制劑在飼料工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)展[J].廣東飼料，1999，(4)：35-37.

[3] 李燕紅，趙輔昆.纖維素酶的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2005，17(5)：392-397.

[4] Bhat M K，Bhat S.Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications[J].Biotechnol Adv，1997，15(3-4)：583-620.

[5] Ventosa A，Nieto J J，Oren A.Biology of moderately halophilic aerobic bacteria[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，1998，62(2)：504-544.

[6] 趙百鎖.中度嗜鹽菌在生物技術(shù)中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報，2007，34(2)：359-362.

[7] 諸葛健，王正祥.工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1994：211-212.

[8] 欒軍.現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)設(shè)計優(yōu)先方法[M].上海：上海交通大學(xué)出版社，1995：128-196.