羅 俊，高淑紅，陳長華，葉蕊芳，武 培，賴 珅，馬朝安

(1.華東理工大學生物工程學院 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；2.河南天方藥業(yè)股份有限公司，河南 駐馬店 463003)

螺旋霉素[1](Spiramycin，SPM)是十六元大環(huán)內酯類抗生素，對于感染性疾病治療具有臨床應用和推廣價值，在其它領域也有進一步拓展的空間。其主要成分為螺旋霉素Ⅰ(SPMⅠ)、螺旋霉素Ⅱ(SPMⅡ)、螺旋霉素Ⅲ(SPMⅢ)。根據(jù)干燥標準品計算，效價應不低于4100 IU·mg-1，其組分要求為：SPMⅠ≤80.0%，SPMⅡ≤5.0%，SPMⅢ≤10.0%；三者的總和應不少于90%。

在螺旋霉素發(fā)酵過程中，主要雜質UNK4與主要組分SPMⅠ僅差一個甲基[2]。陳劍鋒等[3]在研究甲基化因子對西索米星發(fā)酵過程的影響時，發(fā)現(xiàn)加快甲基化反應速率有助于增加西索米星前體物質的積累，改變其部分代謝通路，可大大提高發(fā)酵組分。氯化膽堿在代謝中與蛋氨酸和甜菜堿類似，可以提供生物化學過程所需要的甲基。因此，作者在此研究了在發(fā)酵過程中添加氯化膽堿對發(fā)酵產螺旋霉素及組分的影響，進而優(yōu)化螺旋霉素發(fā)酵的培養(yǎng)條件。

1 實驗

1.1 儀器

FUS-15L型自動控制發(fā)酵罐，華東生物技術工程公司；JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝科學儀器研究所；717 Plus-Auto sampler型HPLC分析儀，Waters公司。

1.2 菌株和培養(yǎng)基

生二素鏈霉菌(Streptomycesambofaciens)，河南天方藥業(yè)。

二級種子培養(yǎng)基：糊精，黃豆餅粉，玉米漿，酵母粉，豆油，(NH4)2SO4，KH2PO4，NaCl，MgSO4，CaCO3，pH值6.4。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：糊精，黃豆餅粉，玉米漿，酵母粉，豆油，(NH4)2SO4，KH2PO4，NaCl，KCl，Zn2SO4，CoCl2，MgSO4，CaCO3，pH值6.4。

1.3 方法

1.3.1 搖瓶發(fā)酵

一級種子培養(yǎng)：250 mL三角瓶裝量為30 mL，(27±0.5)℃、220 r·min-1培養(yǎng)48 h。

搖瓶發(fā)酵：250 mL三角瓶裝量為25 mL，(27±0.5)℃、220 r·min-1培養(yǎng)6 d。

考察了不同甲基化試劑、氯化膽堿添加條件對螺旋霉素發(fā)酵的影響。

1.3.2 15 L發(fā)酵罐放大實驗

將甘油管中的菌種接入500 mL一級種子瓶(27±0.5)℃培養(yǎng)48 h；按相同接種量接入500 mL二級種子瓶，同溫培養(yǎng)24 h；再接入15 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)6 d。一罐為對照罐，即按正常培養(yǎng)基配方進行發(fā)酵；一罐為條件罐，即在120 h時添加0.66 g·L-1氯化膽堿。每隔8 h取樣，分別測定發(fā)酵液的pH值、總糖含量、NH2-N含量、效價，并根據(jù)所測參數(shù)調節(jié)混合料的補加速率?；旌狭贤Ａ蠒r間一般在120 h左右，選擇在停料之后添加氯化膽堿，不同批次根據(jù)菌體的生長狀況調整停料時間，相應的添加氯化膽堿的時間也可以提前。

1.3.3 分析測試

總糖和氨氮含量的測定：采用斐林試劑法和甲醛法[4]。

生物效價和化學效價的測定：參照2010版中國藥典，分別采用杯碟法和分光光度法[5]測定。文中所述效價均為生物效價，化學效價測定僅為驗證生物效價測定結果。

HPLC法測定發(fā)酵液的樣品預處理：取一定量螺旋霉素發(fā)酵液于3000 r·min-1離心10 min，取上清液于-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。分析時取1 mL上清液于10 000 r·min-1離心10 min，上清液用0.22 μm合成纖維素聚酯膜真空過濾后即可直接進樣。

HPLC法測定發(fā)酵組分的色譜條件：流動相A為0.035 mol·L-1的乙酸銨溶液，流動相B為乙腈-甲醇(5∶1)溶液，流動相A和B配制完成后用超聲波脫氣備用；流動相速度0.8 mL·min-1；柱溫70℃；檢測器波長232 nm；進樣量10 μL；色譜柱：XTerra RP18，5 μm，250 mm×4.6 mm。

HPLC法測定發(fā)酵液中有機酸的色譜條件：流動相為10 mmol·L-1磷酸溶液，用K2HPO4溶液調節(jié)pH值至2.3±0.1，配制完成后用超聲波脫氣備用；流動相速度1 mL·min-1；進樣量20 μL；檢測器波長210 nm；柱溫30℃；色譜柱：XTerra RP18，5 μm，250 mm×4.6 mm。

采用以下3種方法對發(fā)酵液中的有機酸組分定性：(1)在相同的色譜條件下，將樣品色譜圖與有機酸標準色譜圖進行對照，根據(jù)保留時間確定樣品中的有機酸；(2)在樣品中加入有機酸的標準液，根據(jù)峰高的突增來進一步驗證色譜峰的歸屬；(3)比較各有機酸在標準液和發(fā)酵液色譜圖中的紫外吸收光譜圖。

有機酸組分的定量分析：采用HP化學工作站中HP增強型積分算法進行積分，有效控制峰面積測量的精確度。由HPLC圖譜積分得出對應各個有機酸峰的峰面積，利用標準曲線換算得到有機酸濃度。

2 結果與討論

2.1 甲基化試劑對螺旋霉素發(fā)酵的影響

96 h為發(fā)酵產螺旋霉素的高峰期。因此，在96 h時，向發(fā)酵液中分別添加0.8 g·L-1的甲基化試劑葉酸、甲硫氨酸、VB12、氯化膽堿以及甜菜堿，其對螺旋霉素發(fā)酵的影響見表1。

表1 甲基化試劑對螺旋霉素發(fā)酵的影響

由表1可知，氯化膽堿對螺旋霉素的生物合成有明顯的促進作用，葉酸、甲硫氨酸、VB12對螺旋霉素的生產不利，而甜菜堿對螺旋霉素促進效果不明顯，其價格也較氯化膽堿昂貴，不利于工業(yè)化大生產。因此，選擇氯化膽堿作為甲基化試劑進行后續(xù)實驗。

2.2 氯化膽堿添加條件的優(yōu)化

2.2.1 氯化膽堿的添加時間

分別在72 h、96 h、120 h時各添加0.4 g·L-1、0.6 g·L-1、0.8 g·L-1、1.0 g·L-1、1.2 g·L-1的氯化膽堿，以不加氯化膽堿作為對照，結果見圖1。

氯化膽堿濃度(g·L-1)，1～5：0.4，0.6，0.8，1.0，1.2；6.對照

由圖1可知，在發(fā)酵72 h時添加氯化膽堿，無論添加量多少均會產生明顯的抑制作用，然而隨著時間的推后，這種抑制現(xiàn)象逐漸減弱，到發(fā)酵中后期(96 h)時，發(fā)酵效價隨著添加量的增大呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢；到發(fā)酵末期(120 h)時，促進作用很明顯，而且只有在高添加濃度下抑制效應才明顯。

2.2.2 氯化膽堿的添加濃度

單因子設計(One-factor design，OFD)[6]是一種單因素五水平的實驗設計方法。它將實驗因素與實驗結果的相互關系用多項式近似，并將其函數(shù)化，依此研究因素與響應值之間的相互關系，并進行優(yōu)化。對實驗數(shù)據(jù)進行多項式回歸，即可得到一元三次方程，該方程表明因子對響應值的影響。

Y=β0+β1x+β2x2+β3x3

(1)

式中：Y為預測響應值即螺旋霉素的效價；β為回歸系數(shù)；x為自變量的編碼水平。

運用 MyDesign Design Expert 7.0[7]軟件對實驗數(shù)據(jù)按式(1)進行方差分析，以得到的復相關系數(shù)平方(R2)來表示因子與響應值的擬合性質，并用F檢驗分析顯著水平。對方程求導，便可得到其極值點，即最優(yōu)化的條件。

采用單因子法設計實驗，以氯化膽堿的添加濃度為影響因子(A)、螺旋霉素的效價為響應值，在發(fā)酵后期(120 h)添加氯化膽堿，結果見表2。

表2 氯化膽堿添加濃度的單因子實驗

對表2數(shù)據(jù)進行多項式回歸分析，擬合三次方程為：

Y=21372.61+3063.67A-2984.72A2-3850.67A3

(2)

實驗數(shù)據(jù)分析見表3。

表3 響應面立方模型分析

由表3可知，該實驗模型的P值小于0.05，說明模型是顯著的，失真值5.08，模型誤差不顯著。表4是對模型可信度的分析。

表4 模型可行性分析

由表4可知，信噪比為19.136(軟件認為該值大于4即表示模型的可信度較高)，表明該模型能用于指導設計適合的實驗范圍，R2=0.9850，表明該因素及其多次項能解釋Y變化的98.5%，模型擬合程度較好。

通過軟件分析，得到氯化膽堿的最優(yōu)添加濃度為0.66 g·L-1，預計效價可達21 921 U·mL-1。

綜上所述，氯化膽堿最優(yōu)的添加條件為：添加時間為120 h，添加濃度為0.66 g·L-1。添加氯化膽堿后，對螺旋霉素生產有促進作用，搖瓶效價提高15%左右。

2.3 氯化膽堿對搖瓶發(fā)酵組分的影響

在120 h時添加濃度為0.66 g·L-1的氯化膽堿，以未添加的作為對照，兩組實驗分別做5次重復，取平均值，結果見表5。

表5 氯化膽堿對發(fā)酵組分的影響/%

由表5可知，添加氯化膽堿之后，各主要雜質含量均有不同程度的降低，而有效組分SPMⅠ的含量也相應有所提升，達到了預期效果。

2.4 氯化膽堿對15 L發(fā)酵罐螺旋霉素發(fā)酵過程參數(shù)的影響

2.4.1 對總糖、氨氮含量的影響(圖2)

圖2 添加氯化膽堿后總糖與氨氮的走勢

由圖2可知，兩批罐采用同種生產工藝控制，兩批罐的總糖、氨氮含量走勢基本一致。

2.4.2 對pH值、效價的影響(圖3)

圖3 添加氯化膽堿后pH值與效價的走勢

由圖3可知，在120 h添加氯化膽堿后，條件罐pH值快速下降，在128 h后趨于穩(wěn)定，pH值穩(wěn)定在5.9左右；而對照罐pH值則變化不大，穩(wěn)定在6.2左右，這可能和氯化膽堿是弱酸性溶液有關。

由圖3還可知，進入生產末期后，對照罐的效價增長速度逐漸放緩，而條件罐在添加氯化膽堿后，效價一直穩(wěn)步提升。

2.4.3 對螺旋霉素組分時序性的影響(表6)

表6 氯化膽堿對螺旋霉素時序性的影響

由表6可知，在120 h添加0.66 g·L-1氯化膽堿后，各主要雜質組分的含量均有一定程度的降低，其中雜質UNK4的含量變化顯著，由對照罐的2.11%降至1.18%，其它雜質UNK2由6.57%降至6.35%、雜質B由1.17%降至0.55%，對應的有效組分SPMⅠ的含量由85.56%提升至89.98%。

2.4.4 對代謝過程中有機酸的影響(圖4)

圖4 發(fā)酵過程中有機酸濃度的變化趨勢

由圖4可知，補加氯化膽堿后，與對照罐相比，條件罐的丙酮酸濃度降低，丙酸濃度基本不變，檸檬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、蘋果酸以及乙酸濃度均有不同程度的提高，其中檸檬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸以及蘋果酸均為TCA循環(huán)中的重要代謝中間產物，它們均有不同程度的積累，說明氯化膽堿的加入有助于增大TCA循環(huán)通量。

葡萄糖進入細胞以后，首先經過EMP代謝途徑轉化為丙酮酸后，才能進一步進入TCA循環(huán)，丙酮酸濃度的變化一定程度上可以反映菌體對糖的利用情況。胞內生成的丙酮酸主要轉化為乙酰CoA和草酰乙酸，丙酮酸濃度的降低說明該轉化向草酰乙酸進行，而草酰乙酸為生成丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA的主要底物，不僅提供了內酯環(huán)合成所需要的三碳前體，同時還能緩解底物抑制效應，使多余的二碳前體(如乙酰CoA和丙酰CoA)能夠在?；然傅淖饔孟逻M一步轉化成為丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA，促進大環(huán)合成，提高生物效價。

3 結論

通過添加甲基化試劑，使得搖瓶發(fā)酵產生螺旋霉素的產量和發(fā)酵液中有效組分含量得到了提高。氯化膽堿的最優(yōu)添加時間為120 h、最優(yōu)添加濃度為0.66 g·L-1，此條件下螺旋霉素效價提高約15%，各主要雜質的含量均有一定程度的降低，其中UNK4的含量變化最顯著，而有效組分的含量相應有所提升。

同樣條件下，在15 L發(fā)酵罐放大實驗中添加氯化膽堿，各主要雜質組分的含量均有一定程度的降低，其中雜質UNK4變化最顯著，由對照罐的2.11%降至1.18%，有效組分的含量也由85.56%提升至89.98%。

[1] 朱峰，王爾健.螺旋霉素的再評價[J].中國抗生素雜志，1991，16(3)：231-236.

[2] Murali Pendela.Characterization of impurities in spiramycin by liquid chromatography/ion trap mass spectrometry[J].Rapid Communication in Mass Spectromery，2007，21(4)：599-613.

[3] 陳劍鋒，王航，張元興，等.促甲基化因子對西索米星發(fā)酵的影響[J].微生物學通報，2006，33(4)：85-90.

[4] 劉剛，徐志南，徐蓉，等.磷酸鎂對螺旋霉素發(fā)酵的影響[J].中國抗生素雜志，1999，22(3)：231-233.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京：化學工業(yè)出版社，2010：附錄81.

[6] 胡蓉.丙三醇對螺旋霉素生物合成過程的影響[J].華東理工大學學報，2009，35(1)：30-34.

[7] 平芮巾.響應面法優(yōu)化海洋細菌MP-2酯酶發(fā)酵條件[J].應用與環(huán)境生物學報，2008，14(4)：548-552.