李 磊，劉雪鋒，阮小云，趙英杰

(1.中國(guó)石油集團(tuán)石油職業(yè)衛(wèi)生技術(shù)服務(wù)中心，河北 廊坊 065000；2.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；3.廊坊師范學(xué)院管理學(xué)院，河北 廊坊 065000)

選取典型防腐劑、維生素以及葡萄糖，開展與生物體重要運(yùn)輸?shù)鞍缀拖赶嗷プ饔醚芯?，可以從分子層面提供生理安全等方面的重要信息[1，2]。苯甲酸鈉(Sodium benzoate，SB)(圖1A)是最常用的食品、藥物防腐劑。維生素C(Vitamin C，VC)(圖1B)是人體必需的重要維生素，是食品、飲料等常用營(yíng)養(yǎng)添加劑之一。葡萄糖(Glucose，Glu)(圖1C)是生物體必需的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)和能源物質(zhì)，是食品和醫(yī)藥行業(yè)的重要基礎(chǔ)原料。血清白蛋白是生物體血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，能與許多內(nèi)源和外源物質(zhì)可逆結(jié)合[3，4]，是最重要的運(yùn)輸?shù)鞍?；胃蛋白?Pepsin)是胃液中最重要的消化蛋白酶。SB與牛血清白蛋白(BSA)之間的結(jié)合已有報(bào)道[5]，但具體結(jié)合部位不明確；尚未見(jiàn)到SB與Pepsin以及VC、葡萄糖與BSA、Pepsin結(jié)合部位的相關(guān)報(bào)道。

作者采用核磁共振(1HNMR)波譜技術(shù)研究了SB、VC、葡萄糖分別與BSA和Pepsin相互結(jié)合的主要部位，對(duì)分子間的作用方式進(jìn)行了理論推測(cè)。

圖1 苯甲酸鈉(A)、VC(B)和葡萄糖(C)的分子結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和儀器

牛血清白蛋白(>98%，BSA FractionⅤ)，上海華美生物工程公司；胃蛋白酶(生化試劑)、苯甲酸鈉(分析純)、L(+)維生素C(分析純)、α-D-葡萄糖(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；重水(分析純)，北京化學(xué)試劑公司。

ARX-300型核磁共振儀，瑞士Bruker公司。

1.2 方法

20℃時(shí)以D2O為溶劑，首先測(cè)定小分子物質(zhì)的1HNMR譜，然后加入一定量的蛋白質(zhì)，測(cè)定小分子物質(zhì)-蛋白質(zhì)溶液的1HNMR譜，以D2O(化學(xué)位移δ=4.70 ppm)為內(nèi)標(biāo)確定各H原子化學(xué)位移。

2 結(jié)果與討論

2.1 苯甲酸鈉與蛋白質(zhì)的結(jié)合部位

圖2為SB、SB-BSA和SB-Pepsin的1HNMR譜，其中SB-Pepsin1HNMR譜中未標(biāo)出的信號(hào)為Pepsin的1HNMR信號(hào)，譜圖解析結(jié)果列于表1。

圖2 SB、SB-BSA、SB-Pepsin的1HNMR圖譜

表1 SB、SB-BSA、SB-Pepsin的化學(xué)位移值δ及改變量Δδ

由表1可見(jiàn)，分別加入BSA和Pepsin后，SB各H原子化學(xué)位移均略向低場(chǎng)移動(dòng)，表明SB與BSA和Pepsin能夠互相結(jié)合[6]。這種結(jié)合屬于非化學(xué)鍵物理結(jié)合，因此，SB分子中各H化學(xué)位移改變幅度不大；此外，由于SB為水溶性物質(zhì)，因此在蛋白質(zhì)分子中SB的結(jié)合部位不可能是蛋白質(zhì)分子的疏水空腔區(qū)域，而應(yīng)該在臨近蛋白質(zhì)分子表面的親水區(qū)域?qū)?。結(jié)合在蛋白質(zhì)親水區(qū)域?qū)拥腟B分子的羧酸陰離子應(yīng)該與蛋白質(zhì)的親水陽(yáng)離子之間存在靜電相互作用，盡管1HNMR結(jié)果難以給出靜電相互作用的證據(jù)，但從理論上推測(cè)，SB與蛋白質(zhì)分子間的靜電相互作用是可能的。1HNMR結(jié)果顯示SB分子中苯環(huán)上H原子化學(xué)位移均向低場(chǎng)移動(dòng)，說(shuō)明SB與蛋白質(zhì)結(jié)合的主要部位為SB分子的苯環(huán)片段[6]。SB與BSA和Pepsin結(jié)合后，水對(duì)SB溶劑化作用有所減弱，從而使SB苯環(huán)上電子云密度略微降低，SB苯環(huán)H化學(xué)位移應(yīng)該向低場(chǎng)移動(dòng)；同時(shí)，SB與蛋白質(zhì)分子結(jié)合后，SB的苯環(huán)能夠與BSA和Pepsin的芳香性氨基酸殘基的芳香環(huán)之間發(fā)生π-π電子堆積作用[7]，環(huán)電流對(duì)SB苯環(huán)上的H原子去屏蔽效應(yīng)增強(qiáng)，SB苯環(huán)H化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)[8]。

需要指出的是，與Pepsin結(jié)合后SB苯環(huán)H原子化學(xué)位移改變幅度相對(duì)較大，其原因可能是BSA和Pepsin分子結(jié)構(gòu)存在明顯差異。BSA分子中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量比Pepsin多，而β-折疊、Turn結(jié)構(gòu)含量相對(duì)較少[9～11]，因此，BSA分子結(jié)構(gòu)相對(duì)規(guī)整且緊密，而Pepsin分子結(jié)構(gòu)較松散，導(dǎo)致SB苯環(huán)更加接近Pepsin芳香性氨基酸殘基的芳香環(huán)，兩者之間的π-π作用更強(qiáng)。

2.2 VC與蛋白質(zhì)的結(jié)合部位

圖3為VC、VC-BSA和VC-Pepsin的1HNMR譜，譜圖解析結(jié)果列于表2。

圖3 VC、VC-BSA、VC-Pepsin的1HNMR圖譜

表2 VC、VC-BSA、VC-Pepsin的化學(xué)位移值δ及改變量Δδ

由表2可見(jiàn)，分別加入BSA和Pepsin后，VC分子中乙二醇支鏈片段H原子化學(xué)位移均向低場(chǎng)方向移動(dòng)，說(shuō)明VC與BSA和Pepsin的結(jié)合部位是VC分子中乙二醇支鏈片段。VC為非電解質(zhì)，分子結(jié)構(gòu)中富含高電負(fù)性O(shè)原子，因此，從理論上推斷VC分子與BSA、Pepsin之間應(yīng)該存在分子間氫鍵作用。VC分子與BSA和Pepsin分子結(jié)合后，VC-Ha、VC-Hb、VC-Hc和VC-Hd與溶劑水之間的分子間氫鍵數(shù)目減少，H原子周圍電子云密度降低，去屏蔽效應(yīng)增強(qiáng)，其化學(xué)位移向低場(chǎng)方向移動(dòng)，屬于熱力學(xué)熵驅(qū)動(dòng)過(guò)程。與SB的結(jié)合情況類似，與Pepsin結(jié)合后VC分子中乙二醇支鏈片段H原子化學(xué)位移改變幅度相對(duì)較大，這可能也是BSA和Pepsin分子結(jié)構(gòu)差異所導(dǎo)致的。

2.3 葡萄糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合部位

圖4為Glu、Glu-BSA和Glu-Pepsin的1HNMR譜，譜圖解析結(jié)果列于表3。

圖4 葡萄糖、葡萄糖-BSA、葡萄糖-Pepsin的1HNMR圖譜

表3 葡萄糖、葡萄糖-BSA、葡萄糖-Pepsin的化學(xué)位移值δ及改變量Δδ

由表3可見(jiàn)，葡萄糖分子H原子的化學(xué)位移在分別加入BSA和Pepsin后均向低場(chǎng)方向移動(dòng)，說(shuō)明葡萄糖是以整個(gè)分子與BSA、Pepsin互相結(jié)合。葡萄糖是多羥基非電解質(zhì)，與VC類似，葡萄糖的-OH也應(yīng)該與BSA、Pepsin分子間存在分子間氫鍵作用。但是與BSA、Pepsin結(jié)合后，葡萄糖與溶劑水分子間氫鍵數(shù)目減少，使葡萄糖分子中Glu-Ha和Glu-Hb原子周圍電子云密度降低，去屏蔽效應(yīng)增強(qiáng)，其化學(xué)位移向低場(chǎng)方向移動(dòng)。與Pepsin結(jié)合后，Glu-Ha化學(xué)位移改變幅度相對(duì)較大，其原因與SB、VC相類似；但Glu-Hb化學(xué)位移改變幅度反而減弱，這可能是由于Pepsin分子肽鏈比BSA短，不足以有效包裹葡萄糖分子，即與Pepsin結(jié)合時(shí)葡萄糖Glu-Hb部分暴露于水相。

3 結(jié)論

SB與BSA、Pepsin的結(jié)合部位為SB分子中的苯環(huán)片段，除靜電相互作用外，主要以芳香環(huán)間π-π電子堆積作用方式相互結(jié)合。VC與BSA、Pepsin的結(jié)合部位為VC分子結(jié)構(gòu)的乙二醇支鏈片段，而葡萄糖則以整個(gè)分子與BSA、Pepsin結(jié)合；VC、葡萄糖主要以分子間氫鍵方式與BSA、Pepsin結(jié)合。3種物質(zhì)分子與BSA和Pepsin結(jié)合部位H原子的化學(xué)位移改變幅度不大，推測(cè)3種物質(zhì)分子在蛋白質(zhì)分子上的結(jié)合部位可能處于臨近蛋白質(zhì)分子表面的親水區(qū)域?qū)印?/p>

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