陶國慶，李鳳辰，邵 菲，付水林，宮 衡

(華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237)

研究微生物發(fā)酵過程中細胞內代謝物的變化對深入了解及指導發(fā)酵過程具有非常重要的意義。α-酮戊二酸是細胞內關鍵的中間代謝產物，不僅是三羧酸循環(huán)的中間體，還是氮源調節(jié)中的信號分子[1]。研究認為，α-酮戊二酸是氨合成的前體，也是氮源缺乏的信號[2]。

目前，測定細胞內代謝物的含量大多采用HPLC梯度洗脫的方法，過程較為繁瑣[3]。離子對色譜法是將一種與溶質分子電荷相反的離子加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子在色譜中的保留行為[4]。作者在此采用離子對色譜法測定大腸桿菌BL21中α-酮戊二酸的含量，操作簡單，結果可靠。為微生物發(fā)酵過程分析提供了一種有效的途徑。

1 實驗

1.1 菌株、試劑與儀器

菌株：大腸桿菌BL21。

磷酸氫二銨、磷酸、α-酮戊二酸，分析純；10%四丁基氫氧化銨水溶液；甲醇，色譜純；水為三次重蒸水。

Waters型高效液相色譜儀；超聲波振蕩儀；真空抽濾儀。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件的建立

(1)色譜分析柱的選擇

C18反相柱被廣泛用于各類物質的分析，而色譜柱又因生產廠家及填料不同，其分離效果也不同。先后選用Waters symmetry-C18柱、Diamonsil-C18柱及Platisil-C18柱來測定大腸桿菌BL21中α-酮戊二酸的含量，比較分析效果，以確定最佳色譜分析柱。

(2)檢測波長的選擇

分別在214 nm、233 nm、254 nm處檢測α-酮戊二酸標準品含量，比較分析結果，確定最佳波長。

(3)流動相的選擇

實驗室條件下分離酸性物質常加入磷酸鹽緩沖溶液，常用磷酸鹽有KH2PO4、(NH4)2HPO4等，本實驗選用(NH4)2HPO4。由于目標物α-酮戊二酸是弱酸，在水溶液中存在解離平衡，解離程度受溶液pH值的控制，故必須選擇合適的pH值。為達到理想的分離效果，還需要選擇合適的離子對試劑。

1.2.2 樣品處理

(1)樣品的滅活

液氮滅活法：快速取5 mL發(fā)酵液樣品，投入液氮，迅速降低細胞內溫度以抑制酶活性，冰上解凍后收集菌體。

(2)代謝物的抽提[5]

冰甲醇法：在收集的菌體中加1.5 mL 50%冰甲醇(-20 ℃)，打散，置液氮中1 min，冰上放置10 min，反復3次。融化后，于11 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，取上清，-80 ℃保存。

1.2.3 樣品標準溶液的配制

精確稱量0.0500 gα-酮戊二酸標準品，純水溶解，定容至50 mL容量瓶。依次稀釋10倍、20倍、50倍、100倍，得到0.704 mmol·L-1、0.352 mmol·L-1、0.141 mmol·L-1、0.070 mmol·L-1梯度濃度的α-酮戊二酸標準品溶液，經0.22 μm濾膜過濾，備用。

2 結果與討論

2.1 色譜條件

通過實驗，確定色譜條件如下：色譜柱為Platisil-C18柱；流動相為0.5%(NH4)2HPO4-5 mmol·L-1四丁基氫氧化銨，H3PO4調pH值4.0；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為214 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.2 HPLC圖譜

在確定的色譜條件下，α-酮戊二酸標準品和發(fā)酵液樣品的HPLC圖譜見圖1。

圖1 α-酮戊二酸標準品(a)和樣品(b)的HPLC圖譜

由圖1可知，α-酮戊二酸的出峰時間為45.14 min，發(fā)酵液樣品中α-酮戊二酸能夠很好地與其它組分分離。

2.3 標準曲線

以α-酮戊二酸濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，如圖2所示。

圖2 α-酮戊二酸的標準曲線

擬合得線性回歸方程：y=867645x-8426，相關系數R2為0.9996，線性關系極顯著。

2.4 穩(wěn)定性

由于抽提獲得的樣品內代謝物多而復雜且分析儀器為自動進樣，故有必要進行穩(wěn)定性實驗。于-80 ℃取出樣品溶液，12 h內每3 h測定其中α-酮戊二酸含量，結果見表1。

表1 穩(wěn)定性實驗結果

由表1可知，樣品在9 h內是穩(wěn)定的(RSD=0.42%)；9 h后樣品不太穩(wěn)定，α-酮戊二酸含量大幅下降，12 h的RSD為1.07%?？梢?，常溫放置抽提樣品不宜超過9 h，否則目標物α-酮戊二酸會發(fā)生一定程度的降解。

2.5 精密度

取同一樣品連續(xù)進樣5次，進行精密度實驗，結果見表2。

表2 精密度實驗結果(n=5)

由表2可知，連續(xù)進樣5次得到α-酮戊二酸含量的相對標準偏差僅為0.38%，表明方法的精密度較高。

2.6 回收率

取已測定α-酮戊二酸含量的樣品，準確添加一定量α-酮戊二酸標準品，分析檢測，結果見表3。

表3 回收率實驗(n=5)

由表3可知，細胞內α-酮戊二酸的平均回收率為99.38%。

2.7 討論

(1)為監(jiān)控微生物發(fā)酵過程，代謝物必須凍結在取樣時刻，大多數文獻采用冰甲醇滅活，本實驗利用液氮滅活，更加迅速。

(2)在分離細胞內代謝物時發(fā)現，細胞內物質大部分出峰較快，為此加入離子對試劑(四丁基氫氧化銨，常用于分離酸性物質)以控制保留時間；而離子對試劑的濃度也必須在合適范圍，太低不能有效改善分離效果，過高時色譜柱難以清洗，縮短其使用壽命。綜合考慮，選擇5 mmol·L-1的離子對試劑較為適宜。

(3)α-酮戊二酸pKa為5.7，理論上只要提高H+濃度，使pH值小于5.7就可以抑制α-酮戊二酸的解離。在確定的色譜條件下，考察pH值為5.0、4.0、2.5對分離效果的影響。結果發(fā)現，pH值以4.0時分離效果最好。因此，選擇pH值以4.0較為適宜。

3 結論

建立了測定細胞內關鍵代謝物α-酮戊二酸含量的離子對色譜方法：Platisil C18柱，以0.5%(NH4)2HPO4-5 mmol·L-1四丁基氫氧化銨為流動相，H3PO4調pH值為4.0，檢測波長為214 nm。結果表明，α-酮戊二酸與其它代謝物分離效果較好，方法線性相關性高(R2=0.9996)，相對標準偏差為0.38%，平均回收率達99.38%。為微生物發(fā)酵過程分析提供了一條有效的途徑。

[1] Leigh J A，Dodsworth J A.Nitrogen regulation in bacteria and archaea[J].The Annual Review of Microbiology，2007，61(1)：349-377.

[2] Ninfa A J，Jiang P.PII Signal transduction proteins：Sensors ofα-ketoglutarate that regulate nitrogen metabolism[J].Current Opinion in Microbiology，2005，8(2)：168-173.

[3] Buchholz A，Hurlebaus J，Wandrey C，et al.Metabolomics：Quantification of intracellular metabolite dynamics[J].Biomolecular Engineering，2002，19(1)：5-15.

[4] 黃向東，李振宇.反相離子對色譜法保留機理研究[J].山東科學，1989，2(4)：36-40.

[5] Luo B，Groenke K，Takors R，et al.Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis，pentose phosphate pathway and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2007，1147(2)：153-164.