張雪霞，李 寧，李曉露，王 健，王海燕，林 毅，王秀捧，蔣 沁

(微生物藥物國家工程研究中心，河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，河北 石家莊 050015)

普那霉素(Pristinamycin)是由始旋鏈霉菌產(chǎn)生的一種鏈陽性菌素類抗生素，對(duì)包括甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌、萬古霉素耐藥的腸球菌等在內(nèi)的大多數(shù)革蘭氏陽性菌均具有較強(qiáng)的殺菌活性，且抗生素后效應(yīng)較長(zhǎng)，是治療頑固性革蘭氏陽性菌感染的特選藥物[1]。

普那霉素由兩類化學(xué)性質(zhì)不同的物質(zhì)組成，分別是屬于B族鏈陽性菌素的普那霉素Ⅰ和屬于A族鏈陽性菌素的普那霉素Ⅱ，兩者的組合比例大約是30%的普那霉素Ⅰ和70%的普那霉素Ⅱ。由于普那霉素能溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯以及三氯甲烷，微溶于水，不溶于石油醚[2]，因此，分離純化一般采用溶媒萃取法[3～5]。但此法耗用大量溶媒、成本較高、收率較低。

作者在此將普那霉素發(fā)酵液預(yù)處理后，用XAD 1600大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附，經(jīng)洗脫、濃縮、結(jié)晶、干燥，得到了高純度普那霉素，具有良好的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試藥、試劑與儀器

普那霉素發(fā)酵液，華北制藥集團(tuán)新藥公司。

普那霉素ⅠA、ⅡA對(duì)照品(純度≥99%)，自制；XAD1600、XAD7大孔吸附樹脂，上海安瀾德有限公司；D312、HZ816、HZ818大孔吸附樹脂，上海華震科技有限公司；超純水，自制；乙腈，色譜純，美國Merck公司；乙醇，工業(yè)級(jí)；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

高效液相色譜儀(996檢測(cè)器，515泵)，Waters；Loborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，Heidolph公司；PHS-3C 型酸度計(jì)，上海雷磁儀器廠；TGL-16G型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 預(yù)處理

1.2.1 樹脂的預(yù)處理及再生

先用乙醇充分浸泡樹脂，除去致孔劑、色素和雜質(zhì)，用水反復(fù)洗滌至洗滌液加乙醇后無白色渾濁為止；然后用4 BV的2 mol·L-1HCl 溶液攪拌浸泡4 h，用蒸餾水洗至中性；再用4 BV的2 mol·L-1NaOH 溶液攪拌浸泡4 h，洗至中性，備用。再生方法與預(yù)處理基本相同。

1.2.2 發(fā)酵液預(yù)處理

將普那霉素發(fā)酵液用鹽酸調(diào)pH值至3.5～4.0后，加入1%(質(zhì)量濃度)珍珠巖助濾劑，攪拌均勻后板框壓濾，得到普那霉素濾液。

1.3 吸附條件研究

1.3.1 吸附樹脂的篩選

分別量取5種大孔吸附樹脂2.0 g和100 mL 普那霉素濾液于250 mL錐形瓶中，于60 r·min-1、30 ℃振蕩5 h，取上清液測(cè)單位，按式(1)計(jì)算樹脂靜態(tài)吸附量(mg·g-1)。傾出上清液，各加入20 mL 95%乙醇，密封，于60 r·min-1、30 ℃振蕩5 h，取洗脫液測(cè)單位，按式(2)計(jì)算樹脂解吸收率(%)。每組實(shí)驗(yàn)做3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

(1)

(2)

以樹脂對(duì)普那霉素的靜態(tài)吸附量為主要篩選指標(biāo)，并結(jié)合解吸收率進(jìn)行篩選。

1.3.2 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

分別取20 mL樹脂于3根玻璃柱(2.2 cm×22 cm)中，自上而下加入普那霉素濾液，流速分別為3 BV·h-1、 2 BV·h-1、1 BV·h-1，在出口處每50 mL 為一個(gè)樣品，測(cè)各樣品單位，計(jì)算泄漏率(%)。

1.4 解吸條件研究

XAD1600大孔吸附樹脂吸附飽和后，樹脂的顏色很深。為了提高普那霉素產(chǎn)品含量并降低色素比值，采用定量的不同梯度的乙醇-酸水(含0.1%的乙酸)進(jìn)行凈化及洗脫。

取XAD1600大孔吸附樹脂20 mL裝柱，普那霉素濾液500 mL(含普那霉素1006 mg)上柱，控制流速為2 BV·h-1，上樣完畢后，分別采用pH值為4.0的20%乙醇-80%酸水、40%乙醇-60%酸水、70%乙醇-30%酸水、90%乙醇-10%酸水各80 mL進(jìn)行洗脫，洗脫流速為0.5 BV·h-1，分管收集乙醇洗脫液，HPLC在線檢測(cè)，計(jì)算洗脫液中普那霉素的含量和解吸收率。

1.5 萃取與結(jié)晶

用等體積乙酸乙酯萃取洗脫液2次，合并乙酸乙酯相，用無水硫酸鈉脫水后，40 ℃減壓濃縮至10 mL，冷庫靜置12 h，抽濾，得到普那霉素濕粉，干燥，得淡黃色普那霉素精粉。

1.6 HPLC條件

色譜條件：色譜柱為Hypersil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.05%三氟乙酸水(50∶50)，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。普那霉素保留時(shí)間為8.5 min。

分別精密稱取普那霉素對(duì)照品ⅠA 15 mg、ⅡA 35 mg，置于50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解，取10 μL注入色譜儀，采用外標(biāo)法按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算峰面積。測(cè)得普那霉素平均回收率為99.8%(n=5)，RSD為0.26%；最低檢測(cè)濃度為0.013 mg·L-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂篩選結(jié)果

5種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附量和解吸收率見表1。

表1 5種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附量和解吸收率

由表1可以看出，XAD1600大孔吸附樹脂對(duì)活性組分的靜態(tài)吸附量明顯大于其它樹脂且解吸收率也最高，可以達(dá)到對(duì)活性組分的富集作用。故選用XAD1600大孔吸附樹脂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 流速對(duì)泄漏率的影響(圖1)

圖1 流速對(duì)泄漏率的影響

由圖1可以看出，流速較慢時(shí)泄漏率較低，有利于普那霉素的吸附。這是因?yàn)?，流速減緩，普那霉素與樹脂的接觸時(shí)間延長(zhǎng)，有利于樹脂吸附，從而降低了泄漏率。當(dāng)流速從2 BV·h-1降至1 BV·h-1時(shí)，普那霉素的泄漏率相差不大，同時(shí)隨著流速的減慢，操作時(shí)間延長(zhǎng)，提高了生產(chǎn)成本。綜合考慮，選擇流速為2 BV·h-1。

2.3 解吸條件的選擇

乙醇體積分?jǐn)?shù)不同的洗脫液中普那霉素的含量及解吸收率見表2。

表2 乙醇體積分?jǐn)?shù)不同的洗脫液中普那霉素的含量及解吸收率

由表2可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%的洗脫液中普那霉素的含量及解吸收率最高。這是因?yàn)?，普那霉素ⅠA的極性較弱，當(dāng)乙醇含量低時(shí)，洗脫液中主要為ⅡA，導(dǎo)致ⅠA損失較大。因此，普那霉素兩個(gè)活性組分主要集中在90%乙酸-10%酸水(pH=4.0)洗脫液中。故確定洗脫條件為：先用40%乙醇-60%酸水洗脫去除色素及極性大雜質(zhì)，再用90%乙醇-10%酸水(pH=4.0)洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮除去乙醇，得普那霉素濃縮液。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取XAD1600大孔吸附樹脂500 mL裝柱，將普那霉素濾液2200 mL(含普那霉素21.6 g)上柱，控制流速為2 BV·h-1，上樣完畢后，分別采用pH值為4.0的40%乙醇-60%酸水、90%乙醇-10%酸水各2000 mL 洗脫，流速為0.5 BV·h-1，分段收集洗脫液，HPLC在線檢測(cè)，合并高單位洗脫液，濃縮，萃取，結(jié)晶，干燥，得普那霉素精粉，重復(fù)3次，結(jié)果見表3。

表3 不同批次普那霉素分離純化效果(n=3)

從表3可見，普那霉素含量達(dá)到98.5%以上，收率達(dá)64%左右，產(chǎn)品質(zhì)量符合法國藥典規(guī)定。表明該工藝穩(wěn)定，收率高，適合于普那霉素的分離純化。

3 結(jié)論

采用大孔吸附樹脂XAD1600分離純化普那霉素，樹脂的靜態(tài)吸附量達(dá)到45.22 mg·g-1。在吸附流速為2 BV·h-1時(shí)吸附飽和后，用40%乙醇-60%酸水洗脫去除色素及極性大雜質(zhì)，然后再以0.5 BV·h-1的流速用90%乙醇-10%酸水(pH=4.0)洗脫，得到含量98.5%以上、收率64%左右的普那霉素精粉。該方法生產(chǎn)成本低、安全性高、收率穩(wěn)定，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

[1] Mancy D I，Leon N，Preudhomme J.Process for the production of pristinamycin[P].USP 3 154 475，1964-10-27.

[2] Preudhomme J，Tarridec P，Belloc A.Pristinamycine isolement，caracterisation et identification des constiuants[J].Bull Soc Chim Fr，1968，(2)：585-591.

[3] Paquet V，Myint M，Roque C，et al.Partitioning of pristinamycins in aqueous two-phase systems：A first step toward the development of antibiotic production by extractive fermentation[J].Biotechnol Bioeng，1994，44(4)：445-451.

[4] Drogue S，Rolet M C，Thiebaut D，et al.Separation of pristinamycins by high-speed counter-current chromatography.I .Selection of solvent system and preliminary preparative studies[J].J Chromatogr A，1992，593(1-2)：363-371.

[5] 朱自強(qiáng)，關(guān)怡新，李勉，等.雙水相萃取在抗生素制備中的應(yīng)用進(jìn)展[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，1998，19(3)：198-200.