蔣麗群，郭 峰，方 真，龍運(yùn)多，張 帆

(1.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園 熱帶植物資源開放實(shí)驗室生物能源組，云南 昆明 650223；2.中國科學(xué)院研究生院，北京 100049)

隨著化石燃料的短缺和石油價格的增長，應(yīng)用生物方法生產(chǎn)化學(xué)產(chǎn)品的生物煉制技術(shù)倍受關(guān)注[1～3]。

2，3-丁二醇(2，3-BD)是一種極具價值的液體燃料，燃燒值為27 kJ·g-1，可以與甲醇(22 kJ·g-1)、乙醇(29 kJ·g-1)相媲美[4]，在能源、食品及化工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[5～7]，且在染料、增濕和柔順劑、炸藥、香水、藥物載體等領(lǐng)域顯示出潛在的應(yīng)用價值[6，8，9]。因此，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)2，3-BD已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[10～14]。

作者在此以相對廉價的尿素為唯一氮源、以葡萄糖為底物，采用Plackett-Burman實(shí)驗、最陡爬陂實(shí)驗以及中心復(fù)合實(shí)驗相結(jié)合的響應(yīng)面法對產(chǎn)酸克雷伯氏菌發(fā)酵產(chǎn)2，3-BD的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。

1 實(shí)驗

1.1 菌種與培養(yǎng)基

產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)CICC 22912，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

固體培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨 5，牛肉膏 3，NaCl 5，瓊脂 20。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨 5，牛肉膏 3，NaCl 5，初始pH值6.8～7.0。

原始發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖 100，K2HPO413.7，KH2PO43.9，(NH4)2SO46.6，(NH4)2HPO43.3，MgSO4·7H2O 0.25，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，CaCl20.01，EDTA 0.05。

上述培養(yǎng)基均在115 ℃下滅菌20 min(FeSO4·7H2O溶液配制完成后用孔徑0.22 μm的無菌雙層微孔濾膜過濾備用)。

1.2 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：將甘油管保藏的菌種轉(zhuǎn)接至固體培養(yǎng)基，37 ℃下活化12 h。將1環(huán)活化的菌種接種于裝有50 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在轉(zhuǎn)速為120 r·min-1的臺式恒溫?fù)u床中，于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，獲得種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)：將上述種子液按體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在轉(zhuǎn)速為150 r·min-1的臺式恒溫?fù)u床中，于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)80 h。

1.3 實(shí)驗設(shè)計

運(yùn)用響應(yīng)面法，采用 Design-Expert 8.0.2軟件進(jìn)行實(shí)驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析，主要由以下3部分組成：

(1)Plackett-Burman實(shí)驗

根據(jù)微生物生長所需要的營養(yǎng)條件及微生物發(fā)酵的影響因子的一般規(guī)律，在單因素實(shí)驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗設(shè)計，其因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗的因素與水平

(2)最陡爬坡實(shí)驗

爬坡實(shí)驗的起點(diǎn)為單因素實(shí)驗所確定的最優(yōu)點(diǎn)，爬坡的方向由Plackett-Burman實(shí)驗的T值決定，T為正值時爬坡方向為遞增，T為負(fù)值時爬坡方向為遞減；爬坡的步長由T值和單因素實(shí)驗結(jié)果確定。

(3)中心復(fù)合實(shí)驗

根據(jù)響應(yīng)面中心復(fù)合實(shí)驗的設(shè)計原理，以2，3-BD得率為響應(yīng)值，設(shè)計2因素5水平共13個實(shí)驗點(diǎn)的實(shí)驗，其中包括4個析因設(shè)計實(shí)驗點(diǎn)、4個軸點(diǎn)設(shè)計實(shí)驗點(diǎn)以及5個中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗實(shí)驗點(diǎn)。

1.4 分析方法

發(fā)酵液中的葡萄糖、2，3-BD以及3-羥基丁酮均采用高效液相色譜儀(島津CL-20A)測定。色譜柱為Aminex HPX-87H型離子色譜柱(300 mm×7.8 mm，Bio-Rad)，柱溫為60 ℃，流動相為0.005 mol·L-1H2SO4，流速為0.6 mL·min-1，檢測器為RID-10A。按下式計算2，3-BD得率(Y)：

式中：m1、m2、m3分別為2，3-BD、3-羥基丁酮、消耗的葡萄糖的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman實(shí)驗

以2，3-BD得率為響應(yīng)值，每次實(shí)驗重復(fù)3次，取平均值。Plackett-Burman實(shí)驗結(jié)果見表2，顯著性分析見表3。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗結(jié)果

表3 Plackett-Burman實(shí)驗的顯著性分析

由表3可知，X2和X7的P值小于0.05，這表明，尿素和乙酸對2，3-BD得率影響顯著，可通過最陡爬坡實(shí)驗和中心復(fù)合實(shí)驗進(jìn)一步優(yōu)化。而其它不顯著影響因素，根據(jù)系數(shù)或T值的正負(fù)確定該因素為表1中的高或低水平，不再進(jìn)一步優(yōu)化。如葡萄糖的T值為負(fù)，則選其低水平，即80 g·L-1。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗

以單因素實(shí)驗確定的最佳水平(即尿素濃度為4.50 g·L-1、乙酸濃度為0.50 g·L-1)為起點(diǎn)，分別以0.30和0.10為步長，進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗，結(jié)果見表4。

表4 最陡爬坡實(shí)驗結(jié)果

由表4可知，當(dāng)尿素濃度為5.10 g·L-1、乙酸濃度為0.70 g·L-1時，2，3-BD得率最大。

2.3 中心復(fù)合實(shí)驗

中心復(fù)合實(shí)驗結(jié)果、回歸方程系數(shù)顯著性檢驗分析分別見表5和表6。

表5 中心復(fù)合實(shí)驗結(jié)果

表6 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗

由表6得到擬合的多元二次方程為：

由Design-Expert 8.0.2繪制的響應(yīng)面曲線圖及等高線圖見圖1。

由圖1a可知，響應(yīng)值存在最大值。經(jīng)軟件分析預(yù)測，當(dāng)尿素=0.1(即5.13 g·L-1)、乙酸=0.03(即0.703 g·L-1)時，預(yù)測的2，3-BD最大得率為0.456 g·g-1。即最佳的發(fā)酵條件是：葡萄糖80 g·L-1，尿素5.13 g·L-1，CaCl20.01 g·L-1，EDTA 0.05 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g·L-1，乙酸 0.703 g·L-1，K2HPO412.55 g·L-1，KH2PO43.9 g·L-1。此時，2，3-BD的得率達(dá)到0.456 g·g-1，較初始條件提高了23.2%，達(dá)到了理論得率的91.2%。

圖1 響應(yīng)面圖(a)及等高線圖(b)

為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件下進(jìn)行3組平行實(shí)驗，得到2，3-BD得率的平均值為0.454 g·g-1，與回歸方程的預(yù)測值基本一致。

由圖1b可知，等高線圖呈圓形，表明尿素和乙酸的交互作用不顯著。

3 結(jié)論

采用Plackett-Burman實(shí)驗、最陡爬坡實(shí)驗以及中心復(fù)合實(shí)驗相結(jié)合的響應(yīng)面法對產(chǎn)酸克雷伯氏菌產(chǎn)2，3-丁二醇的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：

(1)相比于酵母粉、蛋白胨或銨鹽等氮源，本實(shí)驗采用較為廉價的尿素為唯一氮源，獲得了較高的2，3-丁二醇得率，具有經(jīng)濟(jì)性和工業(yè)化發(fā)展?jié)摿Α?2)應(yīng)用Plackett-Burman實(shí)驗對影響發(fā)酵的因子進(jìn)行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿素和乙酸的濃度對2，3-丁二醇得率具有顯著影響。(3)通過中心復(fù)合實(shí)驗，建立了發(fā)酵產(chǎn)2，3-丁二醇的數(shù)學(xué)模型，經(jīng)分析得到尿素和乙酸的最佳組合為：尿素濃度5.13 g·L-1、乙酸濃度0.703 g·L-1。(4)在最佳發(fā)酵條件下，2，3-丁二醇得率達(dá)到0.456 g·g-1，相對于原始的發(fā)酵條件，得率提高了23.2%，達(dá)到了理論得率的91.2%。

該研究對進(jìn)一步以富含葡萄糖的木質(zhì)纖維素水解液為發(fā)酵底物產(chǎn)2，3-丁二醇的研究具有一定的指導(dǎo)意義，為木質(zhì)纖維素資源的開發(fā)利用奠定了良好的基礎(chǔ)。

[1] Hatti-Kaul R，Tornvall U，Gustafsson L，et al.Industrial biotechnology for the production of bio-based chemicals——A cradle-to-grave perspective[J].Trends Biotechnology，2007，25(3)：119-124.

[2] John R P，Nampoothiri K M，Pandey A.Fermentative production of lactic acid from biomass：An overview on process developments and future perspectives[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2007，74(3)：524-534.

[3] van Haveren J，Scott E L，Sanders J.Bulk chemicals from biomass[J].Biofuels，Bioproducts and Biorefining，2008，2(1)：41-57.

[4] Flickinger M C.Current biological research in conversion of cellulosic carbohydrates into liquid fuels：How far have we come?[J].Biotechnology and Bioengineering，1980，22(S1)：27-48.

[5] Bartowsky E J，Henschke P A.The ′buttery′ attribute of wine-diacetyl-desirability，spoilage and beyond[J].International Journal of Food Microbiology，2004，96(3)：235-252.

[6] Celinska E，Grajek W.Biotechnological production of 2，3-butanediol-current state and prospects[J].Biotechnology Advances，2009，27(6)：715-725.

[7] Soltys K A，Batta A K，Koneru B.Successful nonfreezing，subzero preservation of rat liver with 2，3-butanediol and type I antifreeze protein[J].Journal of Surgical Research，2001，96(1)：30-34.

[8] Syu M J.Biological production of 2，3-butanediol[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2001，55(1)：10-18.

[9] Xiu Z L，Zeng A P.Present state and perspective of downstream processing of biologically produced 1，3-propanediol and 2，3-butanediol[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2008，78(6)：917-926.

[10] Petrov K，Petrova P.High production of 2，3-butanediol from glycerol byKlebsiellapneumoniaeG31[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84(4)：659-665.

[11] Ji X J，Huang H，Du J，et al.Enhanced 2，3-butanediol production byKlebsiellaoxytocausing a two-stage agitation speed control strategy[J].Bioresource Technology，2009，100(13)：3410-3414.

[12] Ji X J，Huang H，Du J，et al.Development of an industrial medium for economical 2，3-butanediol production through co-fermentation of glucose and xylose byKlebsiellaoxytoca[J].Bioresource Technology，2009，100(21)：5214-5218.

[13] Wang A，Wang Y，Jiang T Y，et al.Production of 2，3-butanediol from corncob molasses，a waste by-product in xylitol production[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2010，87(3)：965-970.

[14] Zhang L Y，Yang Y L，Sun J A，et al.Microbial production of 2，3-butanediol by a mutagenized strain ofSerratiamarcescensH30[J].Bioresource Technology，2010，101(6)：1961-1967.